張陽陽,姜興旭

(信陽農林學院 食品學院,河南 信陽 464000)

曲酸(Kojic acid)[1],屬于弱酸性次級化合物是由真菌有氧發(fā)酵產(chǎn)生。具有抑制酪氨酸酶的能力和金屬離子的螯合作用[2],還可作為美白祛斑劑、食品防腐劑、保鮮劑和香料等[3-4],用于食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)具有很高的應用價值,曲酸還可作為香料合成的中間體等[5]。在眾多曲霉屬家族中[6],米曲霉(Aspergillusoryzae)[7]占有重要的地位,人們對米曲霉的研究也越來越多,對發(fā)酵生產(chǎn)曲酸的研究也越來越廣泛。筆者采用響應面法優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)曲酸的工藝參數(shù),確定最佳工藝,為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)曲酸提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

1.1.1 實驗材料

米曲霉Co-26;無水乙醇,葡萄糖,KCl,K2HPO4,HCl,MgSO4·7H2O,FeCl3,FeSO4(均為國產(chǎn)分析純試劑);瓊脂(為生化試劑)。

1.1.2 實驗儀器

立式全自動高壓蒸汽滅菌器(江陰濱江),高速臺式冷凍離心機TL-16(湖南湘儀),紫外可見分光光度計UV-1700(上海奧析)。

1.1.3 培 養(yǎng) 基

斜面培養(yǎng)基:1.5%葡萄糖,0.2%酵母膏,2%瓊脂,pH自然,121 ℃滅菌30 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:10%葡萄糖,0.05% MgSO4·7H2O,2.5%酵母膏,0.05% KCl,0.1% KH2PO4,0.01% FeSO4,6%無水乙醇[8],pH 6.0,121 ℃滅菌30 min。

1.2 試驗方法

搖瓶發(fā)酵實驗:挑取斜面活化的菌體孢子,制成106CFU/mL的孢子懸液,以10%的接種體積分數(shù)50 mL接種于250 mL搖瓶中,轉速控制在160～200 r/min。

曲酸質量濃度[9]采用三氯化鐵比色法來測定。

1.3 單因素法

1.3.1 菌齡的影響

分別按照24,48,60,72,84,96 h的菌齡添加到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中,然后分別測定曲酸的質量濃度。

1.3.2 接種體積分數(shù)的影響

以確定的菌齡時間為準,分別按照5%,10%,15%,20%,25%,30%的接種體積分數(shù)添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別測定曲酸的質量濃度。

1.3.3 發(fā)酵溫度的影響

按照1.3.1和1.3.2的結果,分別選取23,26,29,32,34,37 ℃的溫度下進行培養(yǎng),分別測定曲酸的質量濃度。

1.3.4 發(fā)酵時間的影響

按照1.3.1,1.3.2和1.3.3的結果,分別在2,3,4,5,6,7,8,9 d的天數(shù)下,分別確定曲酸的質量濃度。

1.4 響應面優(yōu)化發(fā)酵條件

響應面實驗法最常用的是Box-Behnken的中心組合法[9]。運用Design Expert 8.0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析,得到最優(yōu)解,進而確定最佳發(fā)酵條件,最后進行實驗復證,最終確定米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)曲酸的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件[10]。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 接種體積分數(shù)對米曲霉曲酸的影響

每一組水平做3組,選取平均值,得到接種體積分數(shù)的篩選試驗結果如圖1所示。實驗結果表明:在接種體積分數(shù)為10%時,曲酸質量濃度達到最大。

圖1 接種體積分數(shù)對曲酸質量濃度的影響Fig.1 Effect of inoculation volume fraction on kojic acid mass concentration

2.1.2 發(fā)酵時間的確定

每一組水平做3組,選取平均值,發(fā)酵時間篩選試驗如圖2所示。從實驗結果得出:發(fā)酵時間為6 d時,曲酸質量濃度達到最大。

圖2 發(fā)酵時間對曲酸質量濃度的影響Fig.2 Effect of fermentation time on kojic acid mass concentration

2.1.3 發(fā)酵溫度的確定

每一組水平做3組,取其平均值,結果如圖3所示。實驗結果表明:在34 ℃時,曲酸質量濃度達到最高。

圖3 發(fā)酵溫度對曲酸質量濃度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the mass concentration of kojic acid

2.1.4 菌齡的確定

菌齡每個水平做3組,取其平均值,篩選結果如圖4所示。實驗結果表明:菌齡為48 h時,曲酸質量濃度達到最高。

圖4 菌齡對曲酸質量濃度的影響Fig.4 Effect of bacterial age on kojic acid mass concentration

2.2 響應面實驗

2.2.1 響應面實驗設計與結果

為了更準確研究各個發(fā)酵條件的交互影響作用,找出影響顯著因子,根據(jù)單因素實驗結果,進行Box-Behnken實驗,設X1為體積分數(shù),X2為發(fā)酵時間,X3為發(fā)酵溫度,X4為菌齡,Y為曲酸質量濃度。設計四因素三水平(表1),共29個實驗點,其中24個析因實驗,5個為中心實驗[11],響應面實驗進行方差回歸分析結果見表2,實驗結果見表3。

表1 Box-Behnken實驗因素與水平Table 1 Box-Behnken experimental factors and levels

表2 響應面實驗擬合二次回歸方差分析Table 2 Response surface experiment fitting quadratic regression analysis of variance

表3 Box-Behnken實驗設計與結果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

方差分析表明:X3對曲酸質量濃度影響顯著,其余三因素影響不顯著,X1和X2,X1和X4,X2和X4,X3和X4兩兩交互效應對曲酸質量濃度高低影響顯著,失擬項反映的是試驗數(shù)據(jù)與模型不相符的情況,P=0.921 6>0.05,失擬不顯著,回歸顯著,模型選擇正確,因此可以用此模型來分析響應值的變化[12]。

2.2.2 響應面圖像分析

為了進一步研究相關變量之間的交互作用及確定最優(yōu)點,通過Design Expert 8.0軟件來進行可視化的分析[13-14],如圖5～7所示,分別顯示了3組以曲酸質量濃度為響應面分析立體圖及等高線圖。

圖5 接種體積分數(shù)與發(fā)酵時間對曲酸質量濃度交互影響Fig.5 The inoculation volume fraction and fermentation time had interactive effects on kojic acid mass concentration

圖6 接種體積分數(shù)與菌齡對曲酸質量濃度交互影響Fig.6 The effect of inoculation volume fraction and bacterial age on kojic acid mass concentration was interactive

圖7 發(fā)酵時間與菌齡對曲酸質量濃度交互影響Fig.7 Fermentation time and bacterial age had interactive effects on kojic acid mass concentration

由圖5～7可以看出:響應者存在最大值,確定為最佳接種體積分數(shù)10.02%,發(fā)酵時間6.23 d,發(fā)酵溫度36.47 ℃,菌齡49.49 h。最終確定為當接種體積分數(shù)10%,發(fā)酵時間6 d,發(fā)酵溫度36 ℃,菌齡49 h時,曲酸質量濃度最大能達到51.19 g/L。

2.2.3 模型驗證

為驗證模型的準確性,在發(fā)酵時間為6 d、發(fā)酵溫度為36 ℃、接種體積分數(shù)10%及菌齡49 h時重復5次實驗得到曲酸的質量濃度50.9 g/L接近預測值,說明該模型準確反映了實際發(fā)酵情況[15]。

3 結 論

通過設計4因素3水平的Box-Behnken試驗優(yōu)化曲酸發(fā)酵工藝參數(shù),對試驗結果進行統(tǒng)計分析,得到R2=99.91%擬合程度非常好的模型[16-17]。結果表明:采用單因素法以發(fā)酵產(chǎn)物曲酸質量濃度為指標依次確定接種體積分數(shù)、最佳的發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和最適合的菌齡等是發(fā)酵工藝參數(shù)的最重要的組成部分,通過響應面對選出的因素進行優(yōu)化,確定最優(yōu)的發(fā)酵工藝參數(shù),為進一步的發(fā)酵培養(yǎng)提供依據(jù)。