姚 敏，冉秋池，龍盛榮，苗雷英

0 引 言

近年來(lái)，采用干細(xì)胞治療疾病一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)及臨床轉(zhuǎn)化研究中，對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行無(wú)創(chuàng)、有效的熒光標(biāo)記具有重要的意義。熒光標(biāo)記技術(shù)不同于放射物標(biāo)記法、生物酶標(biāo)記法等，具有無(wú)放射污染、低細(xì)胞毒性、檢測(cè)技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)。氧化石墨烯熒光量子點(diǎn)(graphene oxide quantum dots, GOQDs)是一種新型無(wú)機(jī)納米材料，被廣泛應(yīng)用研究于熒光標(biāo)記探針技術(shù)，具有發(fā)光波長(zhǎng)寬、穩(wěn)定性好、不易被細(xì)胞分解、標(biāo)記時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是細(xì)胞成像研究最有前途的熒光標(biāo)記物之一。

牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)作為一種牙源性的成體干細(xì)胞，由Seo等[1]于2004年分離并證明其具有多向分化潛能，可作為種子細(xì)胞用于組織再生治療當(dāng)中。PDLSCs作為組織工程的三大要素之一，其在組織內(nèi)的存活、遷移、分布等方面尚未十分明確，因此，選擇一種低毒性、光學(xué)性能較好的標(biāo)記材料進(jìn)行有效的干細(xì)胞示蹤方式具有一定的意義。本研究旨在探究納米GOQDs作為PDLSCs的活細(xì)胞熒光標(biāo)記材料使用的可能性，評(píng)價(jià)GOQDs材料的生物安全性，活細(xì)胞熒光標(biāo)記效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與細(xì)胞氧化石墨烯量子點(diǎn)(XF042，先豐納米，中國(guó))；PBS磷酸緩沖溶液(Hyclone，美國(guó))；胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、0.25 %胰蛋白酶溶液(Gibco，美國(guó))；茜素紅、油紅染液(Sigma，美國(guó))；抗細(xì)胞波形蛋白多克隆抗體、抗角蛋白多克隆抗體(谷歌生物，中國(guó))；CCK-8(同仁化學(xué)，日本)；PDLSCs由正畸減數(shù)離體牙提取分離、培養(yǎng)擴(kuò)增后凍存，受贈(zèng)于南京市口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，P3-P5用于本研究。

1.2 主要儀器

透射電子顯微鏡(TEM，JEM-200CX，日本)；動(dòng)態(tài)光衍射儀(DLS，Brookhaven，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur，美國(guó))；SpectraMax M3 酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國(guó))；激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1，日本)。

1.3 方法

1.3.1GOQDs的表征將GOQDs水溶液超聲處理30 min后，吸取少量液體滴于有碳膜支持的銅網(wǎng)上，烘干后重復(fù)1次，進(jìn)行TEM檢測(cè)，將拍攝的圖像導(dǎo)入ImageJ軟件中，測(cè)定GOQDs的粒徑大小，測(cè)定粒子數(shù)目>50個(gè)；GOQDs經(jīng)完全培養(yǎng)基稀釋后的分散粒徑采用DLS檢測(cè)；對(duì)GOQDs的水溶液進(jìn)行紫外-可見分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)(PL)用于表征樣品的光學(xué)性能。測(cè)試數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin繪制曲線圖。

1.3.2PDLSCs的培養(yǎng)及鑒定將凍存的細(xì)胞于37 ℃水浴復(fù)蘇，培養(yǎng)48 h后消化，1000 r/min, 4 ℃，離心5 min，制備細(xì)胞爬片，細(xì)胞融合率約80%后，使用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，采用波形蛋白、角蛋白一抗封閉，PBS作為陰性對(duì)照。4 ℃過(guò)夜孵育后37 ℃復(fù)溫1 h，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)波形蛋白、角蛋白的表達(dá)。PDLSCs消化后鋪板，細(xì)胞融合率在60%左右，替換培養(yǎng)基為成骨、成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基[2]，每3天換液，分別培養(yǎng)14 d、21 d后進(jìn)行油紅O及ARS染色。

1.3.3GOQDs生物相容性檢測(cè)將PDLSCs計(jì)數(shù)后鋪于96孔板中，1000/孔，貼壁后，采用不同濃度的GOQDs處理細(xì)胞(0、5、10、25、50、100、200、400 μg/mL)，分別孵育24 h、72 h，每孔加入10%的CCK-8后37 ℃孵育2 h，于采用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處吸光度(A值)，計(jì)算細(xì)胞活性；將細(xì)胞鋪于96孔板，采用不同濃度的GOQDs孵育(0、10、25、50 μg/mL)，在培養(yǎng)1、3、6、10 d后換液加入10%的CCK-8，37 ℃孵育 2 h 后，測(cè)吸光度繪制增殖曲線。PDLSCs進(jìn)行GOQDs(0、50 μg/mL)處理后72 h，收集細(xì)胞，制備為單細(xì)胞懸液，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇固定2 h后4 ℃保存，染色前用 PBS 洗去固定液，加 100 μL RNase A 37℃水浴 30 min，再加入 400 μL PL染色混勻，4 ℃避光 30 min。最后上機(jī)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng) 488 nm 處紅色熒光。

1.3.4GOQDs對(duì)PDLSCs的熒光標(biāo)記作用PDLSCs接種于玻璃底板的共聚焦小皿中，在細(xì)胞融合率約為60%時(shí)替換培養(yǎng)基為含50 μg/mL GOQDs的完全培養(yǎng)基，分別于孵育24 h和72 h，采用PBS清洗細(xì)胞3遍后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，探究GOQDs對(duì)PDLSCs的活細(xì)胞熒光標(biāo)記作用。

2 結(jié) 果

2.1 GOQDs的表征干燥后的GOQDs具有較好的分散性，粒子大小均勻，測(cè)定粒徑大小為(6.36±1.41)nm。光學(xué)性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果可見，在紫外-可見吸收光譜中顯示，GOQDs的水溶液在365 nm附近有1個(gè)吸收峰。PL熒光結(jié)果顯示GOQDs在365 nm的激發(fā)光下，455 nm處具有較好的發(fā)射，呈現(xiàn)藍(lán)光。見圖1。

a:透射電子顯微鏡；b:動(dòng)態(tài)光散射；c:紫外吸收波譜；d:PL光譜

圖1 GOQDs的表征

Figure 1 The characterization of GOQDs

2.2 PDLSCs的培養(yǎng)鑒定PDLSCs 抗波形蛋白染色陽(yáng)性，抗角蛋白染色陰性，說(shuō)明所提取的干細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源。PDLSCs的多向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，PDLSCs可形成礦化結(jié)節(jié)，大小不一，茜素紅染色陽(yáng)性，而成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d的油紅染色可見有脂滴形成。說(shuō)明本研究的hPDLSCs有多向分化潛能，具有干細(xì)胞的特性。見圖2。

a：抗波形蛋白染色；b：抗角蛋白染色；c：成骨分化可見礦化結(jié)節(jié)；d：成脂誘導(dǎo)可見細(xì)胞內(nèi)脂滴

圖 2 PDLSCs的鑒定

Figure 2 The identification of hPDLSCs

2.3 GOQDs的生物相容性細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示，各濃度(0、5、10、25、50 μg/mL)GOQDs的細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且24 h細(xì)胞活性與72 h比較無(wú)明顯下降(P>0.05)。0、10、25、50 μg/mL的GOQDs對(duì)細(xì)胞增殖的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。0 μg/mL和50 μg/mL GOQDs的S期、G1期、G2期的細(xì)胞百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，對(duì)細(xì)胞周期不產(chǎn)生影響。因此選取后續(xù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)記濃度為50 μg/mL。見圖3。

2.4 GOQDs熒光標(biāo)記hPDLSCs在加入GOQDs培養(yǎng)24 h時(shí)，可見量子點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，405 nm處顯示藍(lán)光，而隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，GOQDs在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)累積現(xiàn)象，細(xì)胞形貌更為明顯，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。見圖4。

a: 細(xì)胞毒性；b: 細(xì)胞增殖；c、d:分別為0、50 μg/mL GOQDs細(xì)胞周期百分比

圖 3 GOQDs的生物相容性

Figure 3 The biocompatibility of GOQDs

a、d：激光共聚焦顯微鏡； b、c、e、f:熒光標(biāo)記

圖示隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，GOQDs在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)累積現(xiàn)象，細(xì)胞形貌更為明顯，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)

圖 4 PDLSCs與GOQDs共培養(yǎng)時(shí)熒光顯微鏡圖片

Figure 4 Thefluorescent images of PDLSCs when co-culture with GOQDs

3 討 論

酶解組織塊法是一種高效的原代培養(yǎng)PDLSCs的方法[3]。本研究前期證實(shí)在組織工程領(lǐng)域，有序靜電紡絲可誘導(dǎo)PDLSCs骨向分化， PDLSCs在組織工程中具有潛在應(yīng)用價(jià)值[5]。既往研究，已有大量關(guān)于牙源性成體干細(xì)胞PDLSCs作為種子細(xì)胞進(jìn)行組織修復(fù)的文獻(xiàn)報(bào)道[6]。hPDLSCs可獲取于離體的智齒或者正畸減數(shù)牙，具有較強(qiáng)的增殖分化能力。牙周膜干細(xì)胞用于治療疾病的研究目前多處于體外及動(dòng)物模型階段，因而對(duì)干細(xì)胞的有效、無(wú)創(chuàng)熒光標(biāo)記方法的選擇顯得尤其重要。

納米材料和納米醫(yī)藥的發(fā)展，為活細(xì)胞生物標(biāo)記技術(shù)提供了新思路[7]。氧化石墨烯是石墨烯的氧化衍生物，具有優(yōu)秀的理化性能及生物學(xué)性能，能夠進(jìn)一步的功能化，作為藥物/基因載體、同時(shí)具有標(biāo)記作用[8-9]、組織工程[10]等。石墨烯量子點(diǎn)在多種細(xì)胞的活細(xì)胞標(biāo)記當(dāng)中被應(yīng)用研究[11]，包括神經(jīng)干細(xì)胞[12]、牙髓干細(xì)胞[13]、Hela細(xì)胞[14]、人肺癌及乳腺癌細(xì)胞[15]等。PDLSCs作為牙周組織再生工程中良好的種子細(xì)胞，石墨烯量子點(diǎn)標(biāo)記PDLSCs活細(xì)胞對(duì)于PDLSCs存活力及治療效果評(píng)估意義重大。既往的研究報(bào)道中，尚缺乏應(yīng)用PDLSCs作為標(biāo)記對(duì)象的石墨烯基材料的相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究首次采用GOQDs對(duì)PDLSCs進(jìn)行體外標(biāo)記，進(jìn)一步證實(shí)了GOQDs在干細(xì)胞體外標(biāo)記領(lǐng)域的應(yīng)用。本研究所用的GOQDs由TEM圖可見，粒徑較小，在10 nm以內(nèi)，分散性好，在水溶液中能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定；DLS結(jié)果表明GOQDs在完全培養(yǎng)基中能夠形成穩(wěn)定的膠體溶液，石墨烯量子點(diǎn)材料的分散性和穩(wěn)定性是其較為關(guān)鍵的性能。此外，GOQDs的熒光性能是與石墨烯的主要區(qū)別之一，也是其重要特性之一。在紫外-可見吸收光譜的插圖中可見，GOQDs具有明顯的藍(lán)色熒光，在365 nm左右的吸收峰可知，GOQDs在該激發(fā)波長(zhǎng)下，于455 nm左右處有較好的發(fā)射，波譜較寬。以上檢測(cè)說(shuō)明本研究的GOQDs具有良好的熒光效果。

納米材料的生物標(biāo)記應(yīng)用的前提應(yīng)當(dāng)是其具有較低的生物毒性[16]。在干細(xì)胞用于組織再生治療的過(guò)程當(dāng)中，細(xì)胞的活性以及細(xì)胞在局部存留的數(shù)量顯得尤其重要[17]，甚至能夠直接影響再生的水平。本研究發(fā)現(xiàn)，在選擇的標(biāo)記濃度下，GOQDs對(duì)細(xì)胞的活性、增殖及周期并無(wú)影響，說(shuō)明材料在一定的應(yīng)用濃度范圍內(nèi)生物安全性能良好。使用本文的量子點(diǎn)材料標(biāo)記牙髓干細(xì)胞同樣發(fā)現(xiàn)生物相容性良好，同時(shí)熒光標(biāo)記時(shí)間長(zhǎng)[12]。另外，Yang等[18]關(guān)于乳牙牙髓干細(xì)胞的驗(yàn)證中，發(fā)現(xiàn)GOQDs除了熒光標(biāo)記作用，還能夠促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化。本研究中，GOQDs標(biāo)記PDLSCs的熒光效果圖片可見，GOQDs孵育后的細(xì)胞形貌正常，在激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm時(shí)，細(xì)胞激發(fā)藍(lán)光，且隨著孵育時(shí)間的增加，細(xì)胞的形貌更為清晰，說(shuō)明GOQDs易進(jìn)入細(xì)胞，并且主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，與之前的研究[19]類似。本研究采用GOQDs與PDLSCs共培養(yǎng)后經(jīng)熒光顯微鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，量子點(diǎn)在進(jìn)入細(xì)胞前后，細(xì)胞形態(tài)及各項(xiàng)細(xì)胞功能指標(biāo)(細(xì)胞的活性、增殖及周期)均無(wú)明顯變化，提示GOQDs對(duì)PDLSCs具有熒光標(biāo)記作用且不影響干細(xì)胞在體外的生物學(xué)行為。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，GOQDs材料具有良好的材料學(xué)性能，其穩(wěn)定性、熒光性能較好，且對(duì)干細(xì)胞的活性影響較小，生物相容性良好，在PDLSCs的活細(xì)胞標(biāo)記當(dāng)中，具有一定的應(yīng)用潛能。