張 雯,孫銘陽,巫雪茹,朱明玉,李 響,唐思敏,葛賢秀,繆 林

0 引 言

膽管癌起源于膽道上皮細胞，起病隱匿，惡性程度高，難以醫(yī)治且預后極差，5年存活率僅為5%[1]。膽管癌細胞可以通過淋巴管進行遠隔器官及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[2]，無法切除腫瘤的患者平均生存期約為6個月[3]。淋巴管上皮細胞(lymphatic epithelial cells LECs)是淋巴脈管的初始部位，屬于腫瘤微環(huán)境中的重要一環(huán)，也是淋巴轉(zhuǎn)移的重要參與部分[4]。腫瘤區(qū)域豐富的淋巴管網(wǎng)絡也可像腫瘤相關(guān)血管一樣為腫瘤生長提供營養(yǎng)支持[5]。此外淋巴管重塑更利于腫瘤細胞進入淋巴脈管，增加轉(zhuǎn)移的可能[4]。我們通過研究膽管癌細胞調(diào)節(jié)的重組人趨化因子CXCL5(LECs)中趨化因子和炎癥因子的表達情況，發(fā)現(xiàn)膽管癌細胞刺激LECs后，LECs分泌上皮中性粒細胞活化肽-78(epithelial neutrophil-activating peptide-78, ENA-78)蛋白的含量增加。研究表明ENA-78通過與IL-8B受體結(jié)合來傳遞信號[6-7]。我們發(fā)現(xiàn)ENA-78發(fā)揮促進淋巴管生成的作用可能也與IL-8B受體相關(guān)。這可能成為膽管癌腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤生長轉(zhuǎn)移進程的一個潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料膽管癌細胞株RBE、HCCC9810購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購于美國GIBCO公司。淋巴管上皮細胞LECs、上皮細胞完全培養(yǎng)基(ECM)、纖連蛋白購于美國ScienCell公司。0.45 μm過濾器(SLHV033RB)購于美國Millipore公司。人類ENA-78 ELISA試劑盒(#ab100506)購于英國Abcam公司。炎癥因子和趨化因子抗體芯片(QAH-INF-3&QAH-CHE-1)購于美國RayBiotech公司。Matrigel膠(356231)購于美國BD Biosciences公司。IL-8B抑制劑SB225002(SML0716)購于美國Sigma公司?；钚缘鞍譋NA-78 (#300-22)購于美國Peprotech公司。ENA-78中和抗體(鼠單克隆抗體；MAB254) 購于美國R&D公司。CCK8試劑盒購于中國武漢金開瑞公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)膽管癌細胞株RBE,HCCC9810在含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，淋巴管上皮細胞LECs在纖連蛋白包被過夜的培養(yǎng)瓶及ECM完全培養(yǎng)基中生長。細胞在含5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代按1∶3的比例進行。

1.2.2 條件培養(yǎng)基(CM)的制備與分析膽管癌細胞(RBE, HCCC9810)的條件培養(yǎng)基(CCM)的制備：在T150培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)膽管癌細胞，當其達到80%融合時用PBS溫柔潤洗2次，無血清培養(yǎng)基潤洗1次，用8 mL無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h。收集上清液離心過濾去除雜質(zhì)。膽管癌相關(guān)淋巴管上皮細胞(RBE-LECs, HCCC9810-LECs)的條件培養(yǎng)基的制備：用T75組織培養(yǎng)瓶培養(yǎng)LECs，當細胞達到30%融合時，用膽管癌條件培養(yǎng)基(CCM∶ECM=1∶3)培養(yǎng)LECs 3～4 d達到80%細胞融合后，然后換4 mL含1% FBS的ECM培養(yǎng)基。48 h后，將上清液離心并過濾。所得的條件培養(yǎng)基分裝儲存在-80℃冰箱，避免反復凍融，且儲存時間不可超過2個月。

1.2.3 炎癥因子和趨化因子抗體芯片檢測與分析條件培養(yǎng)上清中的炎癥因子和趨化因子通過RayBiotech抗體芯片(QAH-INF-3&QAH-CHE-1)檢測，具體操作步驟按照Raybiotech公司的標準操作流程進行。分析條件培養(yǎng)基中80種常見炎癥因子與趨化因子的分泌情況，并進行數(shù)據(jù)分析篩選目標因子。

1.2.4 確定CCM-LECs分泌ENA-78的平臺期通過收集不同時間點(第0、24、48、72、96小時)的RBE-LECs及HCCC9810-LECs對應的條件培養(yǎng)上清，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)RBE-LECs及HCCC9810-LECs的條件培養(yǎng)上清中ENA-78的含量在第24小時和第48小時濃度逐步上升，并且在第48小時到達平臺期，此后因子濃度基本維持或輕度下降。確定后續(xù)實驗中CCM的最佳收集時間為48小時。

1.2.5 ELISA根據(jù)人類ENA-78 ELISA試劑盒的操作步驟，進行不同條件培養(yǎng)基中ENA-78蛋白的濃度測定。每個樣品進行了3次獨立實驗。

1.2.6 細胞增殖實驗在96板中種入100 μL LECs細胞懸液。每組制備6個重復孔。貼壁后換空白培養(yǎng)基饑餓處理4 h后給予上清或藥物處理，處理方法與淋巴管形成實驗中處理方式相似。處理24 h后，加入10 μL CCK8后避光37 ℃孵育2～4 h后進行450 nm吸光度檢測。每個樣品進行了3次獨立實驗。空白對照組：由DMEM和ECM按濃度1∶1配置。CCM組培養(yǎng)基由第48小時收集的CCM和ECM按濃度1∶1配置。CCM+Anti-ENA-78組：在CCM組培養(yǎng)基制備基礎上加入1 μg/mL ENA-78中和抗體。Anti-ENA-78組：在空白對照組的基礎上加入1 μg/mL ENA-78中和抗體。ENA-78組:在空白對照組培養(yǎng)基制備基礎上加入20 ng/mL的ENA-78活性蛋白。ENA-78+SB225002組:在ENA-78組培養(yǎng)基制備基礎上加入100 nM SB225002。SB225002組：在空白對照組培養(yǎng)基制備基礎上加入100 nmol/L SB225002。

1.2.7 淋巴管形成實驗250 μL基質(zhì)膠于4 ℃冰箱過夜，用預冷的槍頭在冰板上將基質(zhì)膠快速加入預冷的24孔板中，并輕晃使其分布均勻。將24孔板在37 ℃孵育使基質(zhì)膠凝結(jié)。將LECs在含有1%FBS的血清ECM中孵育6 h，隨后均勻種于包被基

質(zhì)膠的24孔板中，并且加入制備好的的條件培養(yǎng)基，分組情況如1.2.6。在37 ℃溫育24 h后，拍攝內(nèi)皮細胞的管狀結(jié)構(gòu)，觀察毛細管狀結(jié)構(gòu)的個數(shù)。進行了3次獨立實驗。

2 結(jié) 果

2.1 膽管癌調(diào)節(jié)的LECs高表達ENA-78蛋白通過統(tǒng)計分析趨化因子和炎癥因子在CCM-LECs與正常LECs培養(yǎng)上清中的濃度，顯示ENA-78、IP-10、GCP-2、MCP-2、MCP-3、MIP-3a、HCC-1、Lymphotactin在CCM刺激后的LECs上清中表達增高，其中ENA-78在CCM-LECs中調(diào)變程度最顯著。I-TAC、MIP-1d、IL-10、MIG、PDGF-BB、CXCL16因子呈現(xiàn)表達下調(diào)。見圖1。

2.2 CCM及CCM-LECs中ENA-78含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在RBE和HCCC9810的腫瘤細胞培養(yǎng)上清中，ENA-78蛋白表達量均<5 pg/mL 。ENA-78蛋白在RBE-LECs、HCCC9810-LECs上清中濃度[(1190.94±120.64、1650.38±103.76)pg/mL]較正常LECs[(354.03±32.50) pg/mL]升高(P<0.01)。

2.3 CCM對淋巴管形成的影響CCM組和CCM+Anti-ENA-78組LECs增殖和淋巴管成管數(shù)均較對照組顯著增強(P<0.05)。CCM+Anti-ENA-78組較Anti-ENA-78組的增殖和成管能力均有明顯增強(P<0.05)；但CCM+Anti-ENA-78組增殖和成管能力較CCM組明顯減弱(P<0.01)。見表1，圖2。

2.4 外源性ENA-78對淋巴管形成的影響ENA-78組的細胞增殖和成管能力均較空白對照組顯著增加(P<0.05)。ENA-78+ SB225002增殖和成管能力較ENA-78組有明顯減弱(P<0.05)。見表2，圖2。

a:上調(diào)因子； b:下調(diào)因子

圖 1 條件培養(yǎng)上清中炎癥因子及趨化因子的表達水平

Figure 1 Secretion of inflammatory factors and chemokines in culture medium

a:CCM中ENA-78對淋巴管形成的影響; b:外源性ENA-78對淋巴管形成的影響

圖 2 CCM中ENA-78對淋巴管形成的影響

Figure 2 The effect of ENA-78 in CCM on lymphangiogenesis

組別細胞增殖(A450值)淋巴管成管數(shù)對照組0.31±0.033.00±0.82CCM組1.19±0.14?27.67±5.73?CCM+Anti-ENA-780.59±0.07?#7.67±1.25?#Anti-ENA-78 0.34±0.02#2.67±1.70#

與對照組比較，*P<0.05；與CCM組比較，#P<0.05

組別細胞增殖 (A450值)淋巴管成管 (數(shù)目)空白對照組0.37±0.063.00±0,82ENA-78組0.79±0.16?15.33±1.25??SB225002組0.30±0.082.33±1.25ENA-78+SB225002組0.31±0.06#4.33±1.25##

與空白對照組相比，*P<0.05、**P<0.01；與ENA-78組相比，#P<0.05、##P<0.01

3 討 論

近年來癌癥領(lǐng)域的研究者不再僅僅局限于腫瘤細胞自身的研究，更關(guān)注腫瘤微環(huán)境在癌癥發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用[8-9]。腫瘤微環(huán)境是一個復雜的網(wǎng)絡,包含各種宿主細胞，免疫細胞，血管和淋巴管網(wǎng)，細胞外基質(zhì)，理化因素等一系列因素，與腫瘤發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移都息息相關(guān)[10]。我們主要關(guān)注微環(huán)境中淋巴脈管發(fā)揮的作用，其中LECs是基質(zhì)淋巴管的一個重要組成部分[4]。故我們選擇LECs作為膽管癌微環(huán)境中一個重要的間質(zhì)細胞進行下一步研究。

ENA-78屬于CXC型趨化因子家族的成員，又被稱為CXCL5。據(jù)研究報道,ENA-78在一些腫瘤組織中高表達，例如胰腺癌，肺癌，大腸癌[11-13]。研究表明，與癌旁和正常志愿者血清相比，ENA-78在腫瘤樣品和患者血清中過表達[14-15]。通過TCGA數(shù)據(jù)庫也初步發(fā)現(xiàn)ENA-78在膽管癌患者腫瘤組織中表達增高。研究表明ENA-78的高表達與總生存期短和腫瘤復發(fā)率高呈正相關(guān)[14]。這表明ENA-78是預測膽管癌的一個潛在指標。高ENA-78表達組根治性手術(shù)后仍然表現(xiàn)出較差的總體生存率[16]。這給予了我們一個啟示：ENA-78可能不僅僅對腫瘤細胞產(chǎn)生作用，也與微環(huán)境中基質(zhì)細胞[16]、免疫細胞[14]或其他組成成分相互聯(lián)系。

ENA-78可以促進腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移，并且促進許多免疫相關(guān)細胞的浸潤與激活[14，17-20]。我們證實CCM能促進淋巴管形成，并且CCM中ENA-78起到了重要的作用。阻斷CCM中ENA-78的表達，可以顯著減弱CCM的淋巴管成管能力。但因為CCM中成分復雜，因子表達繁多，ENA-78雖然是重要的促進淋巴管生成的因子，但不是唯一。正因如此，ENA-78的中和抗體，不能完全的阻斷CCM促進淋巴管生成的能力。為排除CCM中其他因子的干擾，我們設計了外源性ENA-78促進淋巴管形成的實驗。我們發(fā)現(xiàn)外源性ENA-78對淋巴管生成有直接促進的作用，并且可以被IL-8B抑制劑有效阻斷，這表明ENA-78促淋巴管生成可能與其受體IL-8B結(jié)合有關(guān)。

此外，研究表明ENA-78也可通過招募中性粒細胞來促進血管和淋巴管的生成[21]。在膽管癌中，腫瘤細胞依賴PI3K-Akt和ERK1/2信號通路直接招募中性粒細胞[14]。關(guān)于膽管癌細胞是否能體外直接增加細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的研究目前尚有爭議。有研究者認為ENA-78可以在體內(nèi)實驗中提高腫瘤生長和轉(zhuǎn)移能力，但不改變體外腫瘤細胞增殖和侵襲能力[14]。主要因為ENA-78發(fā)揮作用依賴體內(nèi)中性粒細胞的浸潤及介導[14]。但也有研究認為體外能直接增加細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力[16]。這樣的差異主要取決于研究中使用的實驗細胞株不同。這些爭議性研究也給予了我們一個新的思考。ENA-78對膽管癌細胞的作用可能有個體差異，這也許取決于不同個體的腫瘤細胞上受體表達的差異。受體差異性表達也許是指導癌癥患者的個體化治療的一個潛在方向。

綜上所述，我們的研究表明，膽管癌微環(huán)境中的LECs分泌ENA-78蛋白量增加，ENA-78可能通過受體IL-8B發(fā)揮促進淋巴管生成的作用。阻斷ENA-78/IL-8B軸有望成為膽管癌腫瘤微環(huán)境抗腫瘤轉(zhuǎn)移的一個新方向。