麥朗君,饒雪梅,曾學文,張龍奕,林烈桔
過敏性哮喘是一種常見慢性炎性疾病,主要病理學特征是呼吸道炎性反應和氣道重塑,臨床表現(xiàn)為咳嗽、喘鳴及呼吸困難,80%以上過敏性哮喘發(fā)病起始于兒童時期,因此早期診斷和治療對于降低過敏性哮喘發(fā)病率十分重要[1-2]。血清類黏蛋白1樣蛋白3(ORMDL3)基因是ORMDL基因家族成員之一,是一種能引起兒童哮喘的易感基因[3-4],其作用機制是激活T淋巴細胞、負性調節(jié)神經鞘脂類產生、增加未折疊蛋白反應。該基因在人體多處組織中普遍表達,其中肝臟和外周血淋巴細胞中表達最高[5]。輔助性T細胞(Th)與哮喘炎性反應和免疫應答有密切聯(lián)系,且在兒童哮喘中發(fā)揮重要作用[6]。許多研究表明,輔助性T細胞亞群1/輔助性T細胞亞群2(Th1/Th2)狀態(tài)失衡與哮喘發(fā)病密切相關,Th2參與的嗜酸粒細胞(EOS)浸潤在哮喘發(fā)生的過程中有重要作用[7-8]。ORMDL、Th1/Th2與哮喘發(fā)病都有一定聯(lián)系,但目前關于兩者在過敏性哮喘患兒外周血中表達水平相關性的研究較少。因此,本研究通過檢測過敏性哮喘患兒外周血中ORMDL3、Th1/Th2水平,探討過敏性哮喘患兒外周血ORMDL3與T細胞亞群Th1/Th2失衡的關系,為過敏性哮喘的預防和評估提供重要依據(jù),報道如下。
1.1 臨床資料 選取2018年3月—2019年10月海南省儋州市人民醫(yī)院兒科治療過敏性哮喘患兒83例(哮喘組)為研究對象,其中男44例,女39例;年齡3~13(7.38±4.59)歲;就診時合并癥,鼻炎16例,蕁麻疹5例;病情程度,無癥狀8例,輕癥12例,中癥36例,重癥27例;既往過敏史:鼻炎16例,蕁麻疹5例,藥物過敏2例;家族遺傳史18例。選取同期于醫(yī)院健康體檢兒童76例作為對照組,其中男32例,女44例;年齡3~12(6.79±4.96)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準,符合倫理學要求,受試對象或其家長知情同意并簽署知情同意書。
1.2 選擇標準 (1)納入標準:①符合過敏性哮喘診斷標準[9];②年齡3~13歲;③入組前1周未使用抗白三烯、抗組胺類藥物;④入組前4周無全身糖皮質激素應用。(2)排除標準:①患其他呼吸系統(tǒng)疾病;②有糖皮質激素和β2受體激動劑過敏史;③有其他心肺疾病及精神異常;④入組前4周患呼吸道感染。
1.3 觀測指標與方法
1.3.1 樣品采集及保存:于就診或健康體檢當天清晨抽取2組兒童空腹外周靜脈血6 ml,其中4 ml 用于ORMDL3、Th1/Th2指標檢測;2 ml離心收集血清,置于-80℃保存,用于IgE檢測。
1.3.2 外周血ORMDL3 mRNA水平檢測: 以RNA提取試劑盒(北京天根生化有限公司)提取外周血總RNA,逆轉錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司)反轉錄獲得cDNA;采用qRT-PCR儀(美國Bio-Rad公司,型號Bio-Rad iQ5)和miScript SYBR Green qPCR Kit試劑盒(德國QIAGEN公司)對ORMDL3進行擴增;qRT-PCR反應體系共10 μl:miScript SYBR Green Mix 5 μl,cDNA(50 ng/μl)1 μl,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl,ddH2O 3.0 μl。反應條件:95℃、90 s,95℃、30 s,63℃、30 s,40個循環(huán);72℃、10 min。ORMDL3及內參GAPDH引物由上海生工生物公司合成,序列見表1。采用2-△△CT法對外周血ORMDL3 mRNA表達水平進行定量分析。
表1 qRT-PCR引物序列
1.3.3 外周血Th1/Th2水平檢測: RPMI 1640(不含小牛血清FBS)培養(yǎng)基等體積稀釋外周血100 μl,加入刺激劑10 μl,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~6 h?;靹?,加入CD8-PC7和CD3-PC5各10 μl,室溫下避光孵育15 min;加入 100 μl Fix&Perm破膜劑(美國Beckman公司)中的Reagent 1(即固定液),室溫避光孵育15 min;加入PBS 3 ml,離心5 min,棄上清。每管中加入 100 μl Fix&Perm中的Reagent 2(即破膜和溶血液),各管加入IFN-γ-FITC單克隆抗體和IL-4-PE單克隆抗體(美國Beckman公司生產)10 μl,室溫下避光孵育15 min。每管中加入PBS 3 ml, 離心棄除上清; PBS 0.5 ml重懸細胞,流式細胞儀(美國BD公司,型號FACSCalibur)檢測。每個樣本每次檢測1×104個細胞。
1.3.4 肺功能指標、EOS、血清IgE水平檢測:利用肺功能儀(日本美能公司,型號AS-507)檢測患兒安靜睡眠時達峰時間比(TPTEF/TE)、達峰容積比(VPEF/VE);一氧化氮測定儀(廣州瑞普醫(yī)療科技有限公司,型號6900)檢測呼出氣一氧化氮(FeNO);血細胞分析儀(濟南童鑫生物科技公司,型號HB7501)進行分類計數(shù)并計算EOS百分比;ELISA試劑盒(上海冠導生物工程有限公司)測定血清IgE水平。
2.1 2組外周血中ORMDL3 mRNA、Th1、Th2表達水平比較 哮喘組外周血中ORMDL3 mRNA、Th2表達水平均顯著高于對照組(P<0.01),Th1、Th1/Th2水平顯著低于對照組(P<0.01),見表2。
2.2 2組肺功能指標、EOS、血清IgE水平比較 哮喘組FeNO、EOS、血清IgE水平均顯著高于對照組(P<0.05),TPTEF/TE、VPEF/VE顯著低于對照組(P<0.05),見表3。
表2 2組外周血中ORMDL3、Th1、Th2表達水平比較
2.3 外周血ORMDL3 mRNA與Th1/Th2水平相關性分析 Pearson分析結果顯示,過敏性哮喘患兒外周血中ORMDL3與Th1/Th2水平呈負相關(r=-0.587,P<0.05),見圖1。
圖1 過敏性哮喘患兒外周血中ORMDL3 mRNA 與Th1/Th2水平相關性
2.4 ORMDL3 mRNA、Th1/Th2與肺功能指標、EOS、血清IgE水平相關性分析 Pearson法分析結果顯示,過敏性哮喘患兒ORMDL3與TPTEF/TE、VPEF/VE呈負相關(P<0.01),與FeNO、EOS、血清IgE水平呈正相關(P<0.01)。Th1/Th2與TPTEF/TE、VPEF/VE呈正相關(P<0.01),與FeNO、EOS、血清IgE水平呈負相關(P<0.01),見表4。
表3 2組肺功能指標、EOS、血清IgE水平比較
表4 過敏性哮喘患兒ORMDL3、Th1/Th2與肺功能指標、 EOS、血清IgE水平相關性分析
2.5 影響過敏性哮喘的多因素Logistic回歸分析 將是否發(fā)生過敏性哮喘作為因變量,以ORMDL3、Th1/Th2、TPTEF/TE、VPEF/VE、FeNO、EOS、血清IgE為自變量進行Logistic回歸分析,結果顯示ORMDL3、血清IgE是影響過敏性哮喘發(fā)生的危險因素,Th1/Th2是影響過敏性哮喘發(fā)生的保護因素,見表5。
表5 影響過敏性哮喘發(fā)生的多因素分析
過敏性哮喘多發(fā)于兒童時期,是哮喘發(fā)病初期,其發(fā)病特征主要為反復喘息、胸悶、咳嗽、氣促[10-12]。過敏性哮喘發(fā)病的外部原因主要有接觸變應原、物理化學誘因、冷空氣等,而內部原因主要是機體免疫耐受功能受損,致使免疫細胞對自身組織結構破壞,而T淋巴細胞在此過程中發(fā)揮十分重要的作用[13-15]。
ORMDL3是首個被鑒定出的哮喘易感基因,序列高度保守,編碼一種跨膜蛋白[16]。 許多過敏原能導致ORMDL3基因表達上調,最終導致哮喘發(fā)生[17]。且有研究表明,某些哮喘治療藥物可通過下調ORMDL3基因表達達到治療哮喘的目的[18]。Kothari等[19]研究17q21號染色體上與哮喘高度相關的一個基因發(fā)現(xiàn),ORMDL3表達上調導致氣道平滑肌增殖和收縮能力增強,從而提高哮喘患者的氣道高反應性,使哮喘加重。本研究中哮喘組外周血中ORMDL3表達水平顯著高于對照組,提示過敏性哮喘患兒外周血中ORMDL3表達水平高于健康兒童,ORMDL3可能通過在過敏性哮喘患兒外周血中高表達來作用某些哮喘相關基因位點,進一步參與過敏性哮喘發(fā)生發(fā)展,本研究與Kothari等[19]研究結果基本一致。
Th在氣道慢性變應性炎性反應中發(fā)揮重要作用,而Th1和Th2分泌細胞因子,彼此相互抑制,Th1/Th2狀態(tài)失衡在哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮關鍵作用[20]。Th2分泌的細胞因子可促進血清IgE合成、誘導EOS前體分化、激活和趨化EOS。Hwang等[21]研究表明,污染物鄰苯二甲酸二異壬酯在體外抑制Th1極化,增強Nave CD4+T細胞Th2的極化,且鄰苯二甲酸二異壬酯通過產生IL-4、IL-5、血清IgE、IgG1,以及減少IFN-γ、IgG2A誘導過敏性哮喘,增加哮喘患者Caspase-1和Caspase-3的表達,從而證明Th1/Th2的失衡能增加過敏性哮喘的發(fā)生幾率。本研究中哮喘患兒外周血中Th1、Th2、Th1/Th2水平與健康兒童比較有顯著差異。提示過敏性哮喘患兒外周血中Th1/Th2處于失衡狀態(tài),而Th1/Th2細胞因子活化平衡表現(xiàn)為免疫保護,此時的失衡可能引起機體免疫紊亂并誘發(fā)免疫介導的過敏性哮喘。進一步提示哮喘的發(fā)作可能與Th1亞群功能低下,Th2亞群功能亢進有關。本研究與張如幸等[22]研究結果基本一致。
許多研究表明,哮喘患者ORMDL3、Th1/Th2與EOS水平都具有一定的相關性,兩者通過相互作用影響過敏性哮喘患者體內EOS水平,最終影響過敏性哮喘的嚴重程度[23-24]。本研究結果中哮喘患兒FeNO、EOS、血清IgE、TPTEF/TE、VPEF/VE等肺部指標水平均與健康兒童有較大差異。提示過敏性哮喘患兒呼吸道免疫炎性反應水平相對升高,氣道內大量附著黏性液體,患兒小氣道阻力上升,肺功能可能受損,導致TPTEF/TE、VPEF/VE等指標水平明顯下降,與田軍等[25]研究結果基本一致。過敏性哮喘患兒ORMDL3、Th1/Th2與TPTEF/TE、VPEF/VE、FeNO、EOS、血清IgE等指標水平均呈現(xiàn)一定的相關性,提示ORMDL3、Th1/Th2可能通過相互作用影響過敏性哮喘患兒機體內炎性反應水平,導致患兒氣道炎性反應加重,使TPTEF/TE、VPEF/VE等指標水平明顯異常,進一步影響過敏性哮喘的嚴重程度。Logistic回歸分析結果顯示,ORMDL3、血清IgE是影響過敏性哮喘發(fā)生的危險因素,Th1/Th2是影響過敏性哮喘發(fā)生的保護因素。提示ORMDL3、血清IgE、Th1/Th2水平高低影響過敏性哮喘發(fā)生,且隨ORMDL3、血清IgE水平升高及Th1/Th2水平降低,過敏性哮喘發(fā)生幾率升高。
綜上所述,過敏性哮喘患兒外周血中ORMDL3與T細胞亞群Th1/Th2水平呈負相關,ORMDL3在外周血中的表達水平對Th1/Th2狀態(tài)失衡有影響。臨床上應密切關注過敏性哮喘患兒外周血中ORMDL3 mRNA、Th1/Th2的水平,及時做出診斷及預防。但ORMDL3基因的多態(tài)性與哮喘發(fā)生之間的關系仍需進一步研究。