鄒宗楷 林燕玲 沈洪武 翁劍鳴 紀(jì)思靈

套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）占非霍奇金氏惡性淋巴瘤的6%左右，主要發(fā)生于老年男性，常規(guī)化學(xué)治療效果差。MCL典型免疫表型通常為Cyclin D1陽性。顯著的分子生物學(xué)改變是t（11；14）（q13；q32）易位導(dǎo)致高表達(dá)Cyclin D1，研究顯示MCL的發(fā)生還有很多分子遺傳學(xué)因素的參與[1]。C-myc癌基因位于8q24區(qū)，是一種轉(zhuǎn)錄因子，主要通過基因易位、重組擴(kuò)增方式活化，在細(xì)胞增殖、分化及凋亡方面有重要的生物學(xué)功能。惡性淋巴瘤中，C-myc在非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin lymphoma，NHL）細(xì)胞中存在不同程度的高轉(zhuǎn)錄水平，與預(yù)后不良有關(guān)。組蛋白甲基化或去甲基化是一種重要的可逆性的表觀遺傳修飾方式，參與調(diào)控基因結(jié)構(gòu)改變和功能表達(dá)。去甲基化酶分為兩個(gè)家族：LSD1和含有JmjC結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。LSD1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，干擾LSD1能抑制腫瘤細(xì)胞增殖。β-catenin是經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路致癌的關(guān)鍵，在細(xì)胞黏附和增生過程中均有重要作用。MCL細(xì)胞中存在Wnt信號通路β-catenin蛋白異常定位和高表達(dá)，其轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核后與Tcf/Lef結(jié)合，通過組蛋白甲基化啟動(dòng)了包括C-myc等在內(nèi)的Wnt信號通路靶基因轉(zhuǎn)錄激活[2]。本文采用免疫組化檢測MCL組織中C-myc與LSD1、β-catenin蛋白表達(dá)，并分析三者之間的相關(guān)性以及與臨床病理特征的相關(guān)性，為進(jìn)一步探討三種蛋白異常表達(dá)在MCL發(fā)生發(fā)展中的可能分子機(jī)制以及運(yùn)用siRNA技術(shù)進(jìn)行C-myc基因敲除和功能研究提供初步理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床材料

收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院2010年1月—2015年12月收治的30例MCL。其中男性21例、女性9例，年齡51～78歲；結(jié)內(nèi)24例、結(jié)外6例，經(jīng)典型25例、母細(xì)胞型4例、多形性型1例；臨床分期：Ⅰ期6例、Ⅱ期9例、Ⅲ期7例、Ⅳ期8例。以30例淋巴結(jié)良性病變作為對照組。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人C-myc多克隆抗體、鼠抗人β-catenin單克隆抗體購自福州邁新公司、兔抗人LSD1多克隆抗體購自美國Novus公司。SP試劑盒為福州邁新公司產(chǎn)品。美國羅氏BenchMark全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀。

1.3 方法

制作30例MCL和30例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生的石蠟病理組織切片，按SP試劑盒說明書行免疫組化染色，以PBS代替一抗作為空白對照，用陽性對照片作為陽性對照。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

采用半定量積分法：根據(jù)著色強(qiáng)度和著色細(xì)胞所占百分比綜合判斷。（1）按著色強(qiáng)度計(jì)分：無著色為0分，輕度為1分，中度為2分，強(qiáng)著色為3分；（2）按著色百分比計(jì)分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)＜25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：0分為（﹣），1～2分為（﹢），3～4分為（﹢﹢），5～7分為（﹢﹢﹢）。（﹢﹢﹢）者為陽性高表達(dá)。C-myc無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為1分，10%～30%為2分，＞30%為3分。病理醫(yī)師雙盲法進(jìn)行評估。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。秩和檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)性分析比較C-myc與LSD1、β-catenin在MCL中表達(dá)差異，與Costwolds臨床分期的關(guān)系，分析三種蛋白表達(dá)之間相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C-myc與LSD1、β-catenin在MCL中的表達(dá)

C-myc與LSD1的陽性產(chǎn)物主要定位在細(xì)胞核。β-catenin陽性產(chǎn)物主要定位在細(xì)胞質(zhì)/膜。C-myc在MCL中的陽性高表達(dá)率為30%（9/30）（圖1），在對照組陽性高表達(dá)率為10%（3/30）（圖2），兩組相比差異有顯著性（P<0.05），LSD1、β-catenin在MCL組的陽性高表達(dá)率分別為53.33%（16/30）（圖3）和80%（24/30）（圖5），明顯高于淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組中的表達(dá)13.33%（4/30）（圖4）和16.66%（5/30）（圖6），P值均＜0.01）。見表1。

2.2 C-myc與LSD1、β-catenin蛋白表達(dá)與MCL臨床病理特征的相關(guān)性

C-myc的表達(dá)與病變部位（P=0.072）、病理組織類型（P=0.082）、臨床分期（P=0.091）均無相關(guān)性；LSD1表達(dá)與病變部位（P=0.068）、病理組織類型（P=0.078）、臨床分期（P=0.084）均無相關(guān)性；β-catenin的表達(dá)與病變部位（P=0.075）、病理組織類型（P=0.081）、臨床分期（P=0.093）無相關(guān)性。

表1 C-myc、LSD1、β-catenin在MCL中的表達(dá)

表2 MCL組織中LSD1、β-catenin與C-myc表達(dá)的相關(guān)性

2.3 MCL組織中C-myc、LSD1、β-catenin表達(dá)的相關(guān)性

C-myc與LSD1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.47），C-myc與β-catenin表達(dá)存在正相關(guān)發(fā)展趨勢（r=0.42），LSD1和β-catenin表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.54）。P值均小于0.05。見表2。

3 討論

近年來，聯(lián)合化療及利妥昔單抗等生物靶向治療使套細(xì)胞淋巴瘤患者的治療效果顯著提高，但仍有部分患者復(fù)發(fā)耐藥并最終死亡。MCL病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚，多個(gè)因子異常表達(dá)、多個(gè)信號通路異常激活與其發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

1982年Collins首次在白血病細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)C-myc癌基因擴(kuò)增現(xiàn)象，它定位于8q24區(qū)，是一種轉(zhuǎn)錄因子，主要通過基因易位、重組擴(kuò)增方式活化，在細(xì)胞增殖及凋亡方面有重要的生物學(xué)功能[3]。惡性淋巴瘤中，C-myc在DLBCL細(xì)胞存在不同程度的高轉(zhuǎn)錄水平，與預(yù)后不良有關(guān)[4]。C-myc在發(fā)病率較低的MCL中重排發(fā)生率及其預(yù)后意義研究尚少，2014年北協(xié)和邱錄貴[5]使用FISH方法檢測患者C-myc/8q24，發(fā)現(xiàn)C-myc擴(kuò)增或獲得具有獨(dú)立預(yù)后不良因素的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

LSD1是一個(gè)蛋白質(zhì)賴氨酸脫甲基酶，2004年Shi Y等研究發(fā)現(xiàn)在FAD的參與下，LSD1可以使細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3K4和H3K9去甲基化，影響細(xì)胞生化代謝及增殖凋亡[6]。LSD1可特異性去除p53第370位賴氨酸甲基，抑制p53活性，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Procaspase3及C-myc表達(dá)。課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[7-8]：MCL患者腫瘤組織中LSD1蛋白呈高表達(dá)狀態(tài)，采用RNAi技術(shù)下調(diào)套細(xì)胞淋巴瘤Jeko-1細(xì)胞LSD1基因，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Procaspase3及C-myc表達(dá)量減少。

β-catenin在細(xì)胞質(zhì)/膜累積是經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路致腫瘤的關(guān)鍵正性調(diào)節(jié)因子?；虮磉_(dá)譜分析檢測到MCL細(xì)胞中存在Wnt信號通路β-catenin蛋白異常定位和高表達(dá)，其轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核后與Tcf/Lef結(jié)合，通過組蛋白甲基化啟動(dòng)了包括C-myc等在內(nèi)的Wnt信號通路靶基因轉(zhuǎn)錄激活。

圖1 C-myc在MCL高表達(dá)，SP法；圖2 C-myc在反應(yīng)性淋巴結(jié)炎低表達(dá)，SP法；圖3 LSD1在MCL高表達(dá)，SP法；圖4 LSD1在反應(yīng)性淋巴結(jié)炎低表達(dá)，SP法；圖5 β-catenin在MCL高表達(dá)，SP法；圖6 β-catenin在反應(yīng)性淋巴結(jié)炎低表達(dá)，SP法

宋愛琴等[9]應(yīng)用RNAi技術(shù)，經(jīng)慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染Jiyoye細(xì)胞，可沉默C-myc基因，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，揭示沉默C-myc基因在白血病和淋巴瘤靶向治療中的作用。盡管RNAi已廣泛用于腫瘤免疫基因治療方面的研究，但較少RNAi技術(shù)沉默C-myc基因治療MCL的文獻(xiàn)研究。

本研究選用30例臨床及病理確診的MCL行免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：患者腫瘤組織中蛋白C-myc、LSD1、β-catenin呈高表達(dá)狀態(tài)，與對照組相比差異具有顯著性，且C-myc與LSD1、β-catenin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)及正相關(guān)發(fā)展趨勢（rs=0.47和rs=0.42），LSD1與β-catenin呈正相關(guān)（rs=0.54），P值均小于0.05，提示三種蛋白高表達(dá)在MCL發(fā)生及發(fā)展中起一定的促進(jìn)作用，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從臨床MCL患者病理組織的蛋白水平研究提示C-myc可能通過LSD1和β-catenin調(diào)控組蛋白甲基化和Wnt信號通路，但蛋白表達(dá)是否與基因異常符合還有待于分子水平進(jìn)一步研究。小干擾RNA技術(shù)廣泛應(yīng)用，C-myc有望與LSD1、HDAC[11-12]一樣成為人類多種腫瘤靶向藥物研發(fā)的新目標(biāo)，并可能成為精準(zhǔn)治療MCL的新方法。