孟慶雯，楊 洋，魏俊萍，楊珊珊，黃 珊

（海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，海南 ?？?570100）

心肌缺血性疾病是世界范圍內(nèi)常見的致死、致殘疾病之一[1]。心臟缺血會造成心肌細胞缺氧，線粒體氧化磷酸化過程受阻，導致能量代謝障礙和三磷酸腺苷（ATP）生成減少，引起典型的超微結(jié)構(gòu)和代謝改變，對心肌產(chǎn)生不可逆損傷[2]。目前，對于心肌缺血性損傷的作用機制仍未明確。特異性蛋白1（SP －1）是一種核轉(zhuǎn)錄因子，與多種基因的表達相關(guān)[3]。金屬蛋白酶組織抑制劑－3 可通過EGFR ／JNK／SP －1 信號抑制乳鼠心肌細胞增殖，SP － 1 的下調(diào)能促進心肌細胞增殖[4]。MicroRNAs（miRNAs）是一種非編碼的小RNA，可通過與靶基因mRNA 的3′非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達，還可參與多種生物學進程，如腫瘤發(fā)生、造血和組織損傷[5－6]。miR－135b 通過靶向CACNA1C 改善病理性心肌肥大[7]，還可改善心功能受損[8]。缺氧誘導因子1α（HIF －1α）是一種核翻譯因子，在缺氧缺血性疾病中起到重要的生物學作用[9－10]，可靶向抑制HIF －1α 的表達，參與細菌性腦膜炎星形膠質(zhì)細胞的發(fā)育[11]。本研究中探討了SP－1 通過miR －135b／HIF －1α 軸對缺氧誘導心肌細胞損傷的作用，為心肌缺血性疾病的治療提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與細胞

儀器：ELx800TM型酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；T100 型熒光定量聚合酶鏈式反應（q－PCR）儀（伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品＜上海＞有限公司）；Biosciences AccuriC6型流式細胞儀（安諾倫＜北京＞生物科技有限公司）。

試劑：Dulbecco′s modified eagle medium （DMEM，北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清（FBS，賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細胞介素1β（IL －1β）、白細胞介素6（IL －6）酶聯(lián)免疫吸附（ ELISA）試劑盒（上海將來實業(yè)股份有限公司）；DCFH －DA（西格瑪奧德里奇＜上海＞貿(mào)易有限公司）；miScript ⅡRT kit（德國凱杰生物科技有限公司）；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)＜北京＞有限公司）；CCK－8 檢測試劑盒（東仁化學科技＜上海＞有限公司）；HIF－1α 和GAPDH 抗體（艾博抗＜上海＞貿(mào)易有限公司）；HRP 標記二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）； siRNA 陰性對照（siRNA），SP －1 －siRNA（si－SP－1），miR －136b mimic，mimic 陰性對照（mimic NC），miR －136b inhibitor（anti－ miR －136b），inhibitor 陰性對照（anti－NC），HIF －1α 3′－UTR 端序列構(gòu)建的野生型（WT）和突變型（MUT）報告基因質(zhì)粒，均由上海吉凱基因化學技術(shù)公司構(gòu)建合成。

細胞：H9c2 細胞（美國模式培養(yǎng)物保藏所）。

1.2 方法

細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：H9c2 細胞用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃及5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞密度達到80% ～90%時，0.25%胰酶液消化細胞，含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基將細胞重懸，將細胞接種于6 孔板內(nèi)，5 ×104個／孔，于37 ℃及5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h 后進行細胞轉(zhuǎn)染。配制轉(zhuǎn)染混合液A，將siRNA，si－SP－1，miR－136b mimic，mimic NC，anti－ miR－136b，anti－NC 和氯化鈷（CoCl2，HIF－1α激活劑）分別用opti－MEM 稀釋，總體積為250 μL，siRNA 和si－SP －1 終濃度為100 nmol／L，CoCl2終濃度為50 μmol／L[12]，其余序列終濃度為50 nmol／L，混勻，室溫孵育5 min；配制轉(zhuǎn)染混合液B，10 μL Lipofectamine 2 000 加入240 μL opti－MEM 中，混勻，室溫孵育5 min。將A 液和B 液混勻，室溫孵育20 min，加入6孔板內(nèi)。細胞于37 ℃及5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)5 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，并于正常氧含量（21% O2）或缺氧（3% O2）條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，進行后續(xù)實驗。

qRT －PCR 法檢測H9c2 細胞中miR －135b 表達：收集缺氧后或轉(zhuǎn)染48 h 后的H9c2 細胞，Trizol 法提取細胞總的RNA，微量分光光度計檢測RNA 濃度。應用miScript ⅡRT kit 將1 μg RNA 逆 轉(zhuǎn) 錄 成cDNA。按SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明，配制25 μL 反應 體 系 。 miR－135b 上 游 引 物 為 5′－CCAGGCTTCCAGTA CCATTAGG －3′，下游引物為5′－GCTTATGGCTTTTCATTCCT －3′；U6 上 游 引 物 為5′－CTCGCTTCGGCAGCACA－3′ ， 下 游 引 物 為 5′ －AACGCTTCACGAATTTGCGT－3′。反應條件為95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，2－ΔΔCt法計算miR－135b 表達。

CCK －8 法檢測細胞增殖：將轉(zhuǎn)染后的H9c2 細胞接種于96 孔板中，5 ×103個／孔，細胞于37 ℃及5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。向每孔內(nèi)加入10 μL CCK －8 溶液，37 ℃條件下孵育3 h。利用酶標儀測定450 nm 波長處的吸光度。

流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：收集轉(zhuǎn)染后的H9c2細 胞，Annexin V － FITC 和PI 室 溫 條件 下 避光孵 育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

ELISA 檢測細胞TNF －α，IL －1β，IL －6 含量：收集轉(zhuǎn)染后的H9c2 細胞培養(yǎng)物上清液，1 000 r／min 離心20 min，取上清液，按試劑盒說明書檢測。

流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)活性氧簇（ROS）：H9c2 細胞轉(zhuǎn)染后，移除培養(yǎng)物上清液，加入DCFH －DA（濃度為10 μmol／L），37 ℃條件 下孵育30 min，隨后移除DCFH －DA，收集細胞，流式細胞儀檢測。

蛋白質(zhì)印跡(Western Blot，WB)法檢測細胞HIF－1α蛋白表達：收集轉(zhuǎn)染后的H9c2 細胞，RIPA 裂解液裂解細胞，12 000 r／min 離心取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 樣本蛋白進行SDS－PAGE 分離，隨后將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。經(jīng)10%脫脂奶粉封閉后，加入一抗HIF－1α（1 ∶1 000 稀釋）和GAPDH（1 ∶1 500），4 ℃下過夜孵育，再加入HRP 標記二抗（1 ∶2 500 稀釋）室溫孵育1 h 后，ECL 發(fā)光、曝光。

熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR－135b 和HIF－1α靶向關(guān)系：針對HIF－1α 3′－UTR 端序列構(gòu)建野生型（WT）和突變型（MUT）報告基因質(zhì)粒。依法進行細胞轉(zhuǎn)染，將HIF －1α 的WT 和MUT 載體分別與mimic NC，miR－135b mimic 轉(zhuǎn)染至H9c2 細胞中，48 h 后檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 缺氧對H9c2 細胞SP－1 和miR－135b 表達的影響

結(jié)果見圖1 和表1。與0 h 相比，H9c2 細胞在缺氧條件下分別培養(yǎng)12，24，48，72 h 后，細胞內(nèi)SP －1 蛋白表達呈時間依賴性顯著升高（P ＜0.05），miR －135b 表達呈時間依賴性顯著降低（P ＜0.05）。

圖1 缺氧后H9c2 細胞中SP －1 蛋白的表達水平

表1 缺氧后H9c2 細胞中SP－1 蛋白和miR－135b 表達的變化情況（± s，n ＝3）

表1 缺氧后H9c2 細胞中SP－1 蛋白和miR－135b 表達的變化情況（± s，n ＝3）

注：與0 h 相比，a P ＜0.05。

時間0 h 12 h 24 h 48 h 72 h SP －1 蛋白表達1.032 ±0.144 1.298 ±0.071a 1.360 ±0.115a 1.552 ±0.112a 1.607 ±0.113a miR －135b 表達1.023 ±0.106 0.780 ±0.059a 0.697 ±0.071a 0.512 ±0.058a 0.445 ±0.032a

2.2 SP－1 低表達對缺氧后H9c2 細胞增殖和凋亡的影響

結(jié)果見表2、圖2 和圖3。與對照組(A 組)相比，缺氧組(B 組)H9c2 細胞中SP －1 的蛋白表達和細胞凋亡率均顯著升高（P ＜0.05），細胞增殖能力顯著降低（P ＜0.05）；與缺氧＋siRNA 組(C 組)相比，缺氧＋si－SP －1 組(D 組)H9c2 細胞中SP－1 的蛋白表達和細胞凋亡率均顯著降低（P ＜0.05），細胞增殖能力顯著升高（P ＜0.05）。

表2 SP －1 低表達對缺氧后H9c2 細胞增殖和凋亡的影響（± s，n ＝3）

表2 SP －1 低表達對缺氧后H9c2 細胞增殖和凋亡的影響（± s，n ＝3）

注：與A 組相比，a P ＜0.05；與C 組相比，b P ＜0.05。表3 和表4 同。

組別A 組B 組C 組D 組SP －1 蛋白表達1.021 ±0.110 1.467 ±0.055a 1.463 ±0.087 0.238 ±0.039b細胞增殖（%）100.989 ±4.948 67.242 ±3.490a 66.508 ±2.190 83.550 ±2.933b細胞凋亡（%）3.697 ±0.484 14.591 ±1.863a 15.380 ±1.176 4.668 ±0.731b

圖2 WB 法檢測H9c2 細胞中SP －1 蛋白的表達水平

2.3 SP－1 低表達抑制缺氧誘導H9c2 細胞炎性因子和ROS 的產(chǎn)生

結(jié)果見圖4 和表3。與A 組相比，B 組H9c2 細胞上清液中TNF －α，IL－1β，IL－6，ROS 含量均顯著升高（P ＜0.05）；與C 組相比，D 組H9c2 細胞上清液中TNF－α，IL－1β，IL－6，ROS 含量均顯著降低（P ＜0.05）。

2.4 SP－1 低表達對缺氧后H9c2 細胞HIF－1 和miR －135b 表達的影響

圖3 流式細胞術(shù)檢測H9c2 細胞凋亡結(jié)果

圖4 H9c2 細胞中ROS 水平

表3 SP －1 低表達對缺氧后H9c2 細胞炎性因子水平和ROS含量的影響（± s，n ＝3）

表3 SP －1 低表達對缺氧后H9c2 細胞炎性因子水平和ROS含量的影響（± s，n ＝3）

組別A 組B 組C 組D 組TNF－ （pg／mL）2.289±0.300 5.270±0.359a 5.284±0.561 3.901±0.354b IL－1 （pg／mL）13.387±0.954 25.060±1.212a 25.923±1.431 17.198±1.216b IL－6（pg／mL）28.556±1.761 82.707±4.550a 85.369±3.937 56.742±4.081b ROS 相對含量1.032±0.080 1.239±0.075a 1.264±1.059 1.086±0.090b

結(jié)果見圖5 和表4。與A 組相比，B 組H9c2 細胞中HIF －1α 的蛋白表達顯著升高（P ＜0.05），miR －135b表達顯著降低（P ＜0.05）；與C 組相比，D 組H9c2 細胞中HIF－1α 的蛋白表達顯著降低（P ＜0.05），miR－135b 表達顯著升高（P ＜0.05）。

圖5 SP－1 低表達對缺氧后H9c2 細胞中HIF－1 蛋白表達的影響

表4 H9c2 細胞中miR－135b 表達和HIF－1 蛋白表達（X± s，n ＝3）

2.5 miR －135b 靶向調(diào)控HIF－1 基因

miR－135b 與HIF －1α mRNA 3′－UTR 的結(jié)合位點見圖6。由圖7 和表5 顯示，與mimic NC 組(E 組)相比，miR －135b mimic 組(F 組)H9c2 細胞中miR－135b表達顯著升高（P ＜0.05），HIF －1α 蛋白表達顯著降低（P ＜0.05），HIF －1α－WT 熒光素酶活性顯著降低（P ＜0.05），而HIF－1α－MUT 熒光素酶活性無明顯變化（P ＞0.05）；與anti－NC 組(G 組)相比，anti－ miR －135b 組(H 組) H9c2 細 胞 中miR －135b 表 達 顯 著 降 低（P ＜0.05），HIF －1α 蛋白表達顯著升高（P ＜0.05）。

圖6 miR －135b 和HIF －1 3′ －UTR 結(jié)合位點

圖7 miR －135b 對H9c2 細胞中HIF －1 蛋白表達的影響

表5 miR －135b 靶向調(diào)控HIF －1 基因（± s，n ＝3）

表5 miR －135b 靶向調(diào)控HIF －1 基因（± s，n ＝3）

注：與E 組相比，aP ＜0.05；與G 組相比，bP ＜0.05。

相對熒光素酶活性組別miR －135b表達HIF －1蛋白表達E 組F 組G 組H 組HIF －1 －WT 1.021 ±0.102 0.425 ±0.039a HIF －1 －MUT 1.011 ±0.101 1.108 ±0.119 1.019 ±0.101 1.742 ±0.097a 0.992 ±0.101 0.424 ±0.040b 1.037 ±0.078 0.411 ±0.031a 0.983 ±0.099 1.319 ±0.071b

2.6 anti－miR－135b 和HIF－1 激動劑對si－SP－1 轉(zhuǎn)染的缺氧H9c2 細胞中miR－135b 和HIF－1 表達的影響

結(jié)果見圖8 和表6。與si－SP －1 組(I 組)相比，si－SP －1 ＋CoCl2組(J 組)H9c2 細胞中miR －135b 表達無明顯變化（P ＞0.05），HIF －1α 蛋白表達顯著升高（P ＜0.05）；與si－SP －1 ＋anti－NC 組(K 組) 相比，si－SP －1 ＋anti－miR －135b 組(L 組)H9c2 細胞中miR－135b 表達顯著降低（P ＜0.05），HIF －1α 蛋白表達顯著升高（P ＜0.05）。

2.7 SP－1／miR－135b／HIF－1 軸對缺氧后H9c2細胞增殖和凋亡的影響

結(jié)果見圖9 和表7。與I 組相比，J 組H9c2 細胞增殖能力顯著降低（P＜0.05），細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與K 組相比，L 組H9c2 細胞增殖能力顯著降低（P ＜0.05），細胞凋亡率顯著升高（P ＜0.05）。

圖8 H9c2 細胞中HIF －1 的蛋白表達

表6 H9c2 細胞中miR－135b 和HIF－1 的表達（± s，n ＝3）

表6 H9c2 細胞中miR－135b 和HIF－1 的表達（± s，n ＝3）

注：與I 組相比，a P ＜0.05；與K 組相比，b P ＜0.05。下表同。

組別I 組J 組K 組L 組miR －135b 表達0.999 ±0.123 1.064 ±0.090a 1.065 ±0.100 0.206 ±0.027b HIF －1 蛋白表達1.009 ±0.117 2.220 ±0.114a 1.075 ±0.071 1.560 ±0.097b

2.8 SP－1／miR－135b／HIF－1 軸對缺氧后H9c2細胞損傷的影響

結(jié)果見圖10 和表8。與I 組相比，J 組H9c2 細胞ROS，TNF－α，IL－1β，IL－6 的含量顯著升高（P ＜0.05）；與K組相比，L 組H9c2 細胞ROS，TNF －α，IL －1β，IL －6 的含量顯著升高（P ＜0.05）。

3 討論

圖9 SP －1 ／miR －135b ／HIF －1 軸對缺氧后H9c2 細胞凋亡的影響

表7 H9c2 細胞增殖和凋亡的變化（± s，%，n ＝3）

表7 H9c2 細胞增殖和凋亡的變化（± s，%，n ＝3）

組別I 組J 組K 組L 組細胞增殖100.630 ±6.418 48.470 ±2.831a 93.753 ±6.995 63.728 ±4.192b細胞凋亡15.293 ±0.409 41.076 ±1.117a 16.970 ±0.353 35.935 ±1.776b

圖10 SP －1 ／miR －135b ／HIF －1 軸 對 缺 氧 后H9c2 細 胞ROS 水平的影響

表8 H9c2 細胞上清液中ROS 和炎性因子的含量變化（X± s，n ＝3）

心肌缺血是急性心肌梗死的常見原因，可引起不可逆的心肌損傷，包括心肌細胞凋亡和氧化損傷[13－14]。缺氧刺激是心血管疾?。ㄈ缧募」Ｋ馈⒅鲃用}瘤和冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。┎±砩頇C制的重要因素[15]。缺氧促進細胞凋亡，負責病理過程中心肌的解剖重塑[16]。缺血引起的缺氧在心肌缺血性疾病期間可誘導心肌細胞凋亡和氧化應激[17]。SP －1 是調(diào)控多種基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，這些基因?qū)膊〉陌l(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要[18]。SP －1 可促進缺氧后血管內(nèi)皮細胞中環(huán)氧合酶2 的表達，從而促進環(huán)氧合酶2 在主動脈瘤和心力衰竭中的局部表達[19]。SP－1 與心臟疾病密切相關(guān)，但其對缺氧后心肌細胞損傷的作用尚不清楚。

研究表明，SP －1 與心肌細胞的增殖相關(guān)[4]，SP －1的激活與炎癥和心臟肥大相關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，干擾SP －1 表達可減輕缺氧誘導的心肌細胞損傷。miRNA是一種小的、內(nèi)源性非編碼RNA 分子。 臨床研究和動物實驗表明，miRNA 是心臟缺血的潛在生物標志物和治療靶標[21]。 此外，一些miRNA 在心肌細胞程序性死亡中起調(diào)節(jié)作用[22]。心肌梗死可上調(diào)心臟SP －1 的表達，miR－7 a／b 通過抑制SP －1 的表達在心肌梗死誘導的心肌缺血和心室重構(gòu)中發(fā)揮保護作用[23]。miR －135b 是心肌缺血再灌注損傷的重要調(diào)節(jié)劑[24]，其過表達改善心功能受損，抑制NLRP3 ／caspase－1 ／IL －1β途徑的上調(diào)[8]。SP －1 和HIF －1α 同時抑制缺氧狀態(tài)下人微血管內(nèi)皮細胞（HMEC－1）的增殖、遷移和侵襲[25]。本研究結(jié)果顯示，SP －1 是miR －135b 和HIF －1α 的上游基因，可調(diào)控miR －135b 和HIF －1α 的表達。miR －135b 可靶向調(diào)控H9c2 細胞中HIF －1α 蛋白表達，這與SUN 等[6]的研究結(jié)果一致。

眼部的慢性低氧／復氧損傷會導致HIF －1α 水平上調(diào)，奧拉帕尼可通過降低HIF －1α 水平發(fā)揮視網(wǎng)膜保護作用[26]。抑制HIF－1α 表達可減輕低氧性肺泡上皮細胞的炎性反應[27]。右美托咪定通過抑制HIF－1α抑制大鼠神經(jīng)元細胞凋亡，改善腦缺血再灌注損傷[28]。miR －135b 過表達促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖，抑制凋亡[29]。體內(nèi)和體外心肌細胞損傷后，miR －135b 的表達均下調(diào)，miR－135b 過表達可顯著抑制ROS 的產(chǎn)生和NLRP3 ／caspase －1 ／IL －1β 炎癥通路的上調(diào)[8]。本研究結(jié)果顯示，CoCl2和anti－miR －135b 會逆轉(zhuǎn)低表達SP－1 對缺氧H9c2 細胞的保護作用。低表達SP －1 通過miR－135b 抑制HIF－1α 的表達，發(fā)揮對缺氧誘導的心肌細胞損傷的保護作用。

綜上所述，SP－1 低表達通過miR －135b／HIF－1α軸發(fā)揮對缺氧誘導的心肌細胞損傷的保護作用。此結(jié)果可為進一步明確心肌細胞損傷機制和心肌缺血性疾病的治療提供參考。后續(xù)研究中將進一步探討SP－1 低表達通過miR －135b／HIF －1α 軸在心肌缺血性疾病動物模型中的作用。