王莉芳，馮正平，李曉春，張金山

（1. 陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710062； 2. 西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室·藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室·陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062； 3. 中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)解剖與組織胚胎學(xué)教研室，陜西 西安 710062）

腎缺血再灌注導(dǎo)致腎臟血管內(nèi)皮細胞和腎小管上皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，使細胞間的連接喪失，造成細胞凋亡、壞死而引起炎性反應(yīng)，是引起急性腎損傷的重要因素[1－2]，同時也是導(dǎo)致腎移植后功能恢復(fù)困難的主要因素，甚至可能出現(xiàn)急性腎功能衰竭，嚴重的可能導(dǎo)致死亡[3]。胃饑餓素是由28 個氨基酸組成的多肽，是生長激素促分泌素受體(GHS－R)的內(nèi)源性配體[4]，廣泛分布于人、鼠及多種動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織器官中，如腦干、垂體、胃、腸、肝、腎等[5]。胃饑餓素與GHS－R 結(jié)合發(fā)揮作用，通過激活Ca2＋釋放進入細胞內(nèi)，通過Ca2＋刺激生長激素(GH)的釋放[6]。本研究中選用C57 小鼠構(gòu)建腎缺血再灌注損傷模型，探討胃饑餓素對腎缺血再灌注損傷后的保護作用及其機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物：成年C57 小鼠50 只，雄性，SPF 級，體質(zhì)量18 ～22 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證號為SYXK（陜）2013 －001。飼料及鼠籠均購自西安交通大學(xué)動物中心，大鼠飼養(yǎng)溫度為18 ～22 ℃，相對濕度為50% ～60%，自然光照。

儀器：3131 型三氣培養(yǎng)箱，1300 SERIES A2 型生物安全柜，均購自美國Thermo 公司；MCO－18AIC 型二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO 公司)；Do X6 型全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能公司)。

試藥：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa 公司）；胃饑餓素（Sigma 公司）；白細胞介素（IL）－1β，腫瘤壞死因子－α（TNF－α），IL－6，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，均購自Invitrogen 公司；缺口末端標記（TUNEL)試劑盒(Roch 公司）；HK－2 細胞(中科院細胞所)；ERK 一抗，p－ERK 一抗，P38 兔一抗，p－P38 兔一抗，均采購于CST 公司；GHS－R，β－actin 兔一抗及HRP 標記兔二抗，均購自Abcam 公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備

將已適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 的C57 小鼠隨機分為假手術(shù)組（A 組），模型組（B 組），胃饑餓素低、中、高劑量組（C1組、C2組、C3組），各10 只。A 組小鼠僅打開腹腔，游離雙側(cè)腎，不夾閉腎蒂；B 組、C1組、C2組、C3組小鼠稱定質(zhì)量后，腹腔注射戊巴比妥鈉0.1 g／kg 麻醉，仰臥位固定于手術(shù)板上，腹部備皮后酒精消毒，做長約2 cm 的腹部正中切口，打開腹腔，左、右腎脂肪囊內(nèi)游離雙側(cè)腎蒂，無創(chuàng)微血管夾夾閉，觀察腎臟顏色，由紅潤變?yōu)榛野咨硎緤A閉有效，并開始計時，雙側(cè)腎缺血40 min 后移去血管夾，觀察腎臟顏色，出現(xiàn)紫黑至恢復(fù)紅潤提示再灌注良好，手術(shù)線逐層關(guān)腹；C1組、C2組、C3組于再灌注時分別腹腔注射胃饑餓素10，20，40 μg／kg。各組小鼠在術(shù)前12 h 禁食不禁飲?；謴?fù)供血24 h 后，各組小鼠心臟采血并摘取雙側(cè)腎。

1.2.2 ELISA 法檢測小鼠血清IL－1β，IL－6，TNF－α 水平

按ELISA 試劑盒說明書操作，取各組小鼠眼球血，每組4 只，分離血清，檢測缺血再灌注后24 h 的IL－1β，IL－6，TNF－α 水平，用多功能微孔板檢測儀（λ ＝450 nm）測定吸光度（A）。

1.2.3 腎組織過碘酸希夫反應(yīng)(PAS)染色

腎組織切片，置95%乙醇中固定1 min，水洗后再將切片浸于1%過碘酸溶液中氧化5 min 后水洗，把切片放于雪夫試劑中染色5 min 后水洗，再以偏亞硫酸鈉溶液浸泡1 min 后，水洗，自然晾干，滴加1 滴香柏油，置普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 TUNEL 法檢測腎小管上皮細胞凋亡

將4%中性甲醛固定的腎組織常規(guī)石蠟包埋，脫蠟至水，不含DNase 蛋白酶K 消化，以鏈霉親和素（streptavidin）工作液覆蓋孵育樣品，DAPI 復(fù)染封片。200倍顯微鏡下觀察細胞核呈黃色為陽性的凋亡細胞。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT －PCR）檢測腎組織中GHS－R 的表達

各組小鼠腎組織低溫研碎后用Trizol 提取其總RNA，按TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit 試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)成cDNA，根據(jù)SYBRP?remix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒步驟上機檢測，結(jié)果通過計算2－△△Ct進行相對定量計算。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡(WB)法檢測腎組織GHS－R 的表達

低溫研碎后的腎組織用RIPA 裂解液提取其總蛋白，30 μg 的蛋白樣品在10%的SDS－PAGE 凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。PVDF 膜用5%脫脂牛奶封閉2 h。PVDF 膜在4 ℃溫度下與GHS－R 和β－actin 一抗孵育過夜，再用1 ∶2 000 辣根過氧化物酶結(jié)合的二級抗體室溫下孵育1 h。最后，蛋白條帶以化學(xué)發(fā)光法顯色獲得。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad Prism 5 統(tǒng)計軟件分析。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析（One －way ANOVA）表示，組間比較采用Tukey′s Multiple Comparisons Test。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清IL－1 ，IL －6、TNF－ 表達水平

結(jié)果見表1?？梢姡I缺血再灌注后，B 組中IL－1β，IL－6，TNF －α 表達水平均顯著高于A 組（P ＜0.05）；但胃饑餓素處理組（C1組、C2組、C3組）以上3 種指標水平均低于模型組，C2組和C3組顯著降低（P ＜0.05），降低程度與胃饑餓素質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

表1 各組小鼠血清IL －1 ，IL －6，TNF － 表達水平比較（± s，pg ／mL，n ＝10）

表1 各組小鼠血清IL －1 ，IL －6，TNF － 表達水平比較（± s，pg ／mL，n ＝10）

注：與A 組比較，＃P ＜0.05；與B 組比較， P ＜0.05。

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組IL －1 16.54 ±1.68 23.30 ±1.14＃21.90 ±0.80 20.28 ±1.30 19.21 ±0.75 IL －6 286.6 ±13.22 523.5 ±45.07＃491.4 ±22.23 413.2 ±22.80 332.6 ±42.43 TNF －349.2 ±3.694 537.3 ±28.17＃516.9 ±19.03 427.3 ±32.58 378.2 ±15.97

圖1 腎組織染色結(jié)果（ ×200）

2.2 腎組織PAS 染色結(jié)果

結(jié)果見圖1?？梢?，A 組腎組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細胞完整、排列整齊、胞漿豐富；B 組腎小管排列紊亂、胞漿萎縮、細胞間質(zhì)增寬，腎小管上皮細胞腫脹，出現(xiàn)空泡變性，紋狀緣消失，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤，出現(xiàn)明顯的腎損傷。與B 組比較，C1組、C2組和C3組的腎損傷依次明顯減弱，炎性反應(yīng)減弱，其中C2組基本接近A 組水平。

2.3 TUNEL 染色結(jié)果

結(jié)果見圖1。可見，A 組基本無細胞凋亡出現(xiàn)，B 組中腎細胞出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，C1組、C2組和C3組腎細胞的凋亡程度下降，且有隨著胃饑餓素濃度升高而降低的趨勢。

2.4 腎組織中GHS －R mRNA 水平的表達

結(jié)果見圖2?？梢姡I缺血再灌注后，B 組腎組織中GHS－R 轉(zhuǎn)錄水平表達量顯著低于A 組（P ＜0.01），C1組的GHS－R 轉(zhuǎn)錄水平表達量與B 組相比無顯著差異，C2組和C3組有不同程度的升高，且具有顯著性（P ＜0.01），基本達到A 組表達量。

2.5 腎組織中GHS －R 蛋白水平的表達

結(jié)果見圖3?？梢?，與A 組比較，B 組中GHS－R 蛋白顯著降低（P ＜0.01）；C1組、C2組、C3組的GHS－R蛋白水平表達較B 組均有不同程度升高，但C1組無顯著差異，C2組和C3組均顯著升高（P ＜0.05），與轉(zhuǎn)錄水平的趨勢具有一致性。

3 討論

圖2 腎組織中GHS －R mRNA 水平的表達

圖3 腎組織中GHS －R 蛋白水平的表達

腎臟的血流量非常豐富，具有血液代謝廢物過濾及生成尿液排出體外的功能，人雙側(cè)腎臟的血液灌注可達到1 200 mL ／min，是人體重要的器官之一。腎臟對缺血缺氧十分敏感，缺血后，腎細胞就開始積累代謝廢物，出現(xiàn)細胞凋亡。血液重新灌注后，腎組織的功能不能得到立刻恢復(fù)，反而會進一步加劇損傷[7]。缺血再灌注模型損傷的病理反應(yīng)與細胞凋亡和炎性反應(yīng)關(guān)系密切，主要是在缺血再灌注模型過程中出現(xiàn)缺氧，導(dǎo)致氧自由基大量聚集，致使細胞DNA 斷裂，從而誘發(fā)細胞凋亡[8]。同時，在缺血再灌注損傷過程中會導(dǎo)致大量炎性因子的釋放，引起一系列炎性級聯(lián)反應(yīng)，結(jié)合相關(guān)受體，也會激活相關(guān)凋亡基因，導(dǎo)致細胞凋亡[9－11]。

胃饑餓素在腎臟中可激活抗氧化應(yīng)激機制，保護免受血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)引起的腎臟損害[12]。RAJAN等[13]發(fā)現(xiàn)，胃饑餓素可能通過迷走神經(jīng)對動物腎缺血再灌注損傷有防護作用。TAKEDA 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，胃饑餓素可能通過胰島素樣生長因子－1 介導(dǎo)改善內(nèi)皮功能來保護腎臟免受缺血再灌注損傷。這也提示胃饑餓素可能通過多種途徑對腎缺血再灌注損傷起防護作用。

本研究結(jié)果顯示，腎缺血再灌注模型損傷后，B 組炎性因子IL －1β，IL－6，TNF－α 較A 組顯著升高，且腎組織的PAS 染色結(jié)果顯示，炎性細胞浸潤；腎組織切片結(jié)果顯示，細胞有凋亡現(xiàn)象，同時GHS－R 的基因和蛋白水平表達均顯著降低。再灌注時不同質(zhì)量濃度胃饑餓素預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)各組中IL－1β，IL －6，TNF－α 表達水平下降，腎組織的損傷減弱，且炎性癥狀消除，同時凋亡細胞數(shù)量減少，GHS－R 的表達量升高，且這些表現(xiàn)與胃饑餓素的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。結(jié)果顯示，胃饑餓素的預(yù)處理能有效減少腎缺血再灌注模型損傷后的炎性反應(yīng)及細胞凋亡情況，減輕了腎損傷的病理性改變，且促進GHS－R 的表達。提示胃饑餓素能減少腎缺血再灌注模型損傷后的炎性反應(yīng)，而炎性反應(yīng)的減弱有助于腎缺血再灌注模型損傷后功能的恢復(fù)，同時炎性因子的減少可能抑制凋亡基因的激活，進一步減少細胞的凋亡，但有待于進一步研究。腎缺血再灌注模型損傷后胃饑餓素受體GHS－R 的表達顯著降低，胃饑餓素處理后GHS－R 的表達升高，且高劑量胃饑餓素處理后能達到缺血再灌注模型損傷前水平，提示腎缺血再灌注模型損傷后生長素的減少可能是其損失加重的因素，胃饑餓素能通過增加GHS－R 的表達，兩者結(jié)合后能刺激GH 的釋放，起到對腎缺血再灌注損傷模型的保護作用。