蔣學(xué)劍 王志強(qiáng) 王志清

摘要 從湯溝酒廠的酒醅樣品中分離得到一株解磷細(xì)菌，為革蘭氏陽(yáng)性（G+）菌，菌落表面呈金黃色，且形態(tài)圓整，邊緣整齊，成堆排列。經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)，該菌株為微球菌，被命名為Micrococcus NT_1001。分別以KH2PO4和蛋黃卵磷脂（PC）為底物，考察Micrococcus NT_1001對(duì)無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的分解性能。結(jié)果表明，Micrococcus NT_1001可降解無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷，且可轉(zhuǎn)化PC生產(chǎn)甘油磷酸膽堿（GPC）;培養(yǎng)溫度、pH和培養(yǎng)基中的初始磷濃度對(duì)磷分解率、GPC收率有顯著影響;Micrococcus NT_1001的最適生長(zhǎng)條件為37 ℃，pH 為8.0;初始KH2PO4濃度為60 mg/L時(shí)，KH2PO4的分解率最高，為97.89%;初始PC濃度為10 g/L時(shí)，GPC收率最高，為1.33%;KH2PO4和PC都對(duì)Micrococcus NT_1001存在底物抑制作用。

關(guān)鍵詞 酒醅;微球菌;解磷;PC;GPC;底物抑制

Abstract A wild grampositive （G+） phosphatedissolving bacteria was isolated from the fermented grains samples of Tanggou Distillery.The colony surface was golden yellow，and the colony shape was round.The colony edges were neat and arranged in piles.The aligned 16S rDNA sequence indicated that this strain belonged to Micrococcus sp，which was named as Micrococcus NT_1001.The decomposition performance of Micrococcus NT_1001 on inorganic phosphorus and organic phosphorus was investigated separately by using KH2PO4 and egg yolk lecithin （PC） as substrate.The results showed that Micrococcus NT_1001 could degrade effectively inorganic phosphorus and organic phosphorus，and also convert PC to glycerol phosphate choline （GPC）;culture temperature，pH and initial phosphorus concentration in the medium had significant effects on the phosphorus decomposition rates and GPC yields;the optimal growth condition of Micrococcus NT_1001 was 37 ℃，pH 8.0;when the initial concentration of KH2PO4 was 60 mg/L，the highest decomposition rate of KH2PO4 was obtained，the corresponding value was 97.89%;when the initial PC concentration was 10 g/L，the highest GPC yield （1.33%） was obtained;both KH2PO4 and PC had substrate inhibitory effects on Micrococcus NT_1001.

Key words Fermented grains;Micrococcus;Phosphate dissolving;PC;GPC;Substrate inhibition

磷既是水體富營(yíng)養(yǎng)化的關(guān)鍵性限制因子，也是微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的必需元素之一。因此，解磷不僅是環(huán)保領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，也是生物催化過(guò)程的研究重點(diǎn)之一[1]。

具有解磷作用的微生物種類較多，主要包括芽孢桿菌、沙雷氏菌、假單胞桿菌、微球菌、固氮菌、埃希氏菌、霉菌等[2-9]。無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷在這些微生物細(xì)胞內(nèi)的降解、轉(zhuǎn)化途徑不同。其中，微生物對(duì)無(wú)機(jī)磷的降解途徑通常包括：①乳酸、氨基乙酸、草酸、延胡索酸、琥珀酸、2-葡糖酮酸和檸檬酸等有機(jī)酸溶解磷酸鹽[10-12];②通過(guò)呼吸作用降低環(huán)境pH，引起磷酸鹽溶解[13-15];③釋放H2S，并使其與磷酸鐵反應(yīng)，生成硫酸亞鐵和可溶性的磷酸鹽等[16-17]。而微生物細(xì)胞對(duì)有機(jī)磷的分解是通過(guò)胞外磷酸酶的分泌和酶解過(guò)程實(shí)現(xiàn)。微生物從含磷有機(jī)物中的碳（C）中獲得能量，而有機(jī)物中的磷（P）則以代謝產(chǎn)物的形式被釋放出來(lái)[18-19]。同時(shí)，細(xì)菌具有負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)有機(jī)磷酸酯的G-3-P，即sn-3-磷酸甘油結(jié)合蛋白依賴性UgpBAEC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，其中UgpB是周質(zhì)空間結(jié)合蛋白，UgpA和UgpE是膜內(nèi)嵌蛋白，而UgpC為滲透酶。因此，解磷細(xì)菌還可能將有機(jī)磷酸酯先轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)，再進(jìn)行酶解[20]。

課題組前期從湯溝酒廠的酒醅樣品中富集、篩選出若干株微生物，并分離得到一株解磷細(xì)菌。筆者擬通過(guò)形態(tài)觀察、16S rDNA序列比對(duì)對(duì)該菌株進(jìn)行種屬鑒定，同時(shí)優(yōu)化該菌株的培養(yǎng)條件，分析菌株代謝產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 菌株 酒醅樣品采集于江蘇湯溝兩相和酒業(yè)有限公司，經(jīng)富集分離后獲得單菌落。

1.2 試劑 牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、KH2PO4、NaOH、瓊脂等生化試劑均為分析純，購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司;蛋黃卵磷脂（純度99.9%），西安澤邦生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1109C型超凈臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）;1290型HPLC（Agilent）;SX700型滅菌鍋[天美（中國(guó)）];MQD-S2R型振蕩培養(yǎng)箱（上海旻泉儀器有限公司）;5810R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）;PHS-3C型精密pH計(jì)（上海精密儀器有限公司）;BS124S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];NTL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器）。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)基。

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g/L，大豆蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂 2 g/L，pH 7.4～7.6。

平板培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g/L，大豆蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂 2 g/L，pH 7.4～7.6。

液體培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g/L，大豆蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L。

將培養(yǎng)基分裝至500 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min，冷卻后使用。

1.4.2 培養(yǎng)條件。

種子培養(yǎng)：從保存的菌株上挑取一環(huán)菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，37 ℃活化24 h，500 mL三角瓶中分裝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基100 mL，121 ℃滅菌20 min;將斜面培養(yǎng)基上的菌種挑取一環(huán)接入液體培養(yǎng)基，置于搖床培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件為37 ℃，200 r/min。

發(fā)酵培養(yǎng)：250 mL三角瓶分裝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基50 mL，121 ℃滅菌20 min，加入KH2PO4母液或蛋黃卵磷脂母液，用已滅菌的吸管吸取1 mL種子液至含磷的培養(yǎng)基中。

1.4.3 蛋黃卵磷脂母液配制。

蛋黃卵磷脂試劑為固體，不易滅菌和添加，故選擇將其配制成一定濃度的母液，以便取用。取蛋黃卵磷脂15 g，加入Milli-Q水成150 mL，得到濃度為100 g/L的蛋黃卵磷脂母液，105 ℃滅菌20 min，冷卻后放入4 ℃ 冰箱備用。

1.4.4 KH2PO4母液配制。稱取4.387 g KH2PO4，加純水溶解后定容至100 mL，得到磷濃度為10 g/L的KH2PO4母液，121 ℃滅菌20 min，冷卻后放入4 ℃冰箱備用。

1.4.5 電鍍廢水樣品處理。

采集的電鍍廢水樣品中含有較多不溶性雜質(zhì)，在使用前進(jìn)行離心。將水樣分別裝入200 mL離心罐中，稱重配平離心，800 r/min離心10 min;離心后的上清液收集起來(lái)，放至4 ℃冰箱備用。

1.4.6 培養(yǎng)溫度。

250 mL三角瓶?jī)?nèi)裝50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min，接種1 mL 種子液，分別置于20、30、37、40 ℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)24 h，每隔一定時(shí)間取樣，測(cè)定OD600。

1.4.7 pH。250 mL三角瓶?jī)?nèi)裝50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，利用酸堿調(diào)pH分別為6、7、8、9，121 ℃滅菌20 min，接種1 mL種子液后置于搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)24 h，每隔一定時(shí)間取樣，測(cè)定OD600。

1.4.8 無(wú)機(jī)磷濃度。

250 mL三角瓶?jī)?nèi)裝50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，分別加入不同量的KH2PO4母液，使其濃度分別為0、20、40、60、80、100、120 mg/L，121 ℃滅菌20 min，接種1 mL 種子液，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200 r/min，每隔一定時(shí)間取樣1 mL至2 mL離心管中，測(cè)定OD600;另取5 mL培養(yǎng)液至玻璃試管中，測(cè)定磷含量。

測(cè)定電鍍廢水樣品中總磷濃度，向電鍍廢水中加入牛肉膏、蛋白胨、NaCl，測(cè)定OD600和磷含量。

1.4.9 有機(jī)磷濃度。將已滅菌的蛋黃卵磷脂（PC）按計(jì)算數(shù)值加入已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，混合均勻，使其濃度分別為0、5、10、20、30 g/L，每瓶接種1 mL種子液，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速設(shè)定為200 r/min，測(cè)定OD600和磷含量。

1.4.10 分析。蛋黃卵磷脂（PC）和甘油磷酸膽堿（GPC）測(cè)定：用ES 2000高效液相色譜儀搭配Alltech 2000蒸發(fā)光檢測(cè)儀，采用三元梯度洗脫（表1），流動(dòng)相A為正己烷（含0.04%三乙胺），流動(dòng)相B為異丙醇，流動(dòng)相C為13%乙酸溶液，洗脫流速為1.5 mL/min，柱溫25 ℃。蒸發(fā)光檢測(cè)器采用分流模式，以空氣作為霧化氣，氣體流速為1.7 L/min，漂移管溫度為45 ℃。待測(cè)樣品按照一定濃度溶解于HPLC級(jí)正己烷-異丙醇（體積比為3∶1）混合液中。使用前用0.22 μm孔徑的有機(jī)相濾膜過(guò)濾。

采用鉬酸銨分光光度法測(cè)定樣品中的磷含量[21]。

采用天根生化科技（北京）有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按試劑盒操作流程提取NT_1001基因組DNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷細(xì)菌NT_1001的鑒定

菌落表面呈金黃色，形態(tài)圓整，邊緣整齊，成堆排列（圖1），且革蘭氏染色結(jié)果呈陽(yáng)性（G+）（圖2）。

以NT_1001的DNA作為模板，利用通用引物27F和1492R進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為60 μL：10 ng/μL的引物27F和1492R各3 μL，DNA模板3 μL，2×Taq mix 30 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足至60 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，55 ℃復(fù)性90 s，72 ℃延長(zhǎng)90 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延長(zhǎng)10 min。PCR產(chǎn)物測(cè)序后，通過(guò)Blast將該序列與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果表明，解磷細(xì)菌NT_1001與微球菌Micrococcus luteus 的同源性最高，其同源性系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖3所示。綜合形態(tài)特征和基因序列同源性分析，將菌株NT_1001鑒定為微球菌（Micrococcus sp.） 。

2.2 Micrococcus NT_1001生長(zhǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 溫度。從圖4可以看出，培養(yǎng)溫度從20 ℃增加至37 ℃時(shí)，Micrococcus NT_1001的生長(zhǎng)速率隨著溫度增加而逐漸增加;而當(dāng)培養(yǎng)溫度為40 ℃時(shí)，Micrococcus NT_1001的生長(zhǎng)速率降低。37 ℃是Micrococcus NT_1001生長(zhǎng)的最適溫度。

2.2.2 pH。從圖5可以看出，pH從6.0增加至8.0時(shí)，Micrococcus NT_1001的生長(zhǎng)速率隨著pH增加而逐漸增加;而當(dāng)pH大于8.0時(shí)，Micrococcus NT_1001的生長(zhǎng)速率降低。這表明，Micrococcus NT_1001生長(zhǎng)的最適pH為8.0。

2.3 Micrococcus NT_1001的解磷性能

2.3.1 無(wú)機(jī)磷。

由圖6可知，培養(yǎng)基中KH2PO4含量對(duì)Micrococcus NT_1001生長(zhǎng)有明顯的影響。菌體量隨著KH2PO4濃度的增加而增加。KH2PO4濃度低于60 mg/L時(shí)，Micrococcus NT_1001的生長(zhǎng)量隨著KH2PO4濃度增加而增加;KH2PO4濃度為?除此之外，初始KH2PO4濃度對(duì)磷分解率的影響如圖7所示。從圖7可以看出，當(dāng)初始KH2PO4濃度低于60 mg/L時(shí)，KH2PO4的消耗率隨著初始KH2PO4濃度增加而增加;而當(dāng)初始KH2PO4濃度大于60 mg/L時(shí)，KH2PO4的消耗率逐漸降低。這表明，60 mg/L是Micrococcus NT_1001解磷時(shí)的最佳初始KH2PO4濃度，得到的KH2PO4分解率為97.89%。

由圖8可知，Micrococcus NT_1001在工業(yè)電鍍廢水中也可以生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)情況良好。但是，菌株在工業(yè)電鍍廢水中的磷分解率僅為46.13%（圖9），而菌株在KH2PO4培養(yǎng)基中的解磷率能接近100%。與污水樣品相比，Micrococcus NT_1001在含磷液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況較好。這可能是由于電鍍廢水中含有其他雜質(zhì)和抑制因子，對(duì)菌株的代謝途徑產(chǎn)生了抑制作用。

2.3.2 有機(jī)磷。

從圖10可以看出，Micrococcus NT_1001能夠分解PC。當(dāng)初始PC濃度小于20 g/L時(shí)，PC分解率隨著初始PC濃度增加而顯著增加;而當(dāng)初始PC濃度大于20 g/L時(shí)，PC分解率降低。這表明PC對(duì)Micrococcus NT_1001可能存在底物抑制作用。最佳初始PC濃度為20 g/L。

在Micrococcus NT_1001降解PC的代謝產(chǎn)物中檢測(cè)出GPC。GPC是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)和磷脂前體，具有較高的市場(chǎng)價(jià)值?？疾炝瞬煌跏糚C條件下，Micrococcus NT_1001的GPC產(chǎn)量（圖11）。

從圖11可以看出，在初始PC濃度低于20 g/L時(shí)，GPC產(chǎn)量隨底物PC濃度增加而增加;當(dāng)初始PC濃度大于20 g/L時(shí)，GPC產(chǎn)量降低。這一結(jié)果與圖9中PC的分解率變化趨勢(shì)一致。同時(shí)，通過(guò)計(jì)算不同條件下GPC收率，得到初始PC濃度對(duì)GPC收率的影響（圖12）。

從圖12可以看出，當(dāng)初始PC濃度超過(guò)10 g/L時(shí)，GPC收率明顯降低。這表明Micrococcus NT_1001在PC濃度達(dá)10 g/L時(shí)，就已經(jīng)受到底物抑制作用。當(dāng)初始PC濃度為10 g/L時(shí)，GPC收率為1.33%。

3 討論與結(jié)論

磷元素是生物體所需的重要營(yíng)養(yǎng)元素之一，也是原生質(zhì)的重要組分之一。高能磷酸鍵同時(shí)也是微生物所需能量的載體。因此，包括微生物在內(nèi)的生物細(xì)胞體內(nèi)生化過(guò)程正常進(jìn)行都必須有磷元素的加入和作用。該文首次從我國(guó)傳統(tǒng)白酒釀造工藝中取樣，富集、篩選和分離出了一株高效的解磷微生物Micrococcus NT_1001，分析了其培養(yǎng)條件和對(duì)無(wú)機(jī)磷、有機(jī)磷原料的分解和轉(zhuǎn)化性能，初步優(yōu)化了其生產(chǎn)附加值高的GPC產(chǎn)品的條件。但是，Micrococcus NT_1001在分解和轉(zhuǎn)化中的作用機(jī)制尚不明確，且Micrococcus NT_1001在其他生理生化過(guò)程中產(chǎn)生的作用和功效仍需要進(jìn)行深入研究和挖掘。

從湯溝酒廠酒醅中篩選出一株具有良好解磷性能的微球菌，命名為Micrococcus NT_1001，該菌株在37 ℃和pH 8.0條件下的菌體生長(zhǎng)量最高。同時(shí)，考察了Micrococcus NT_1001對(duì)無(wú)機(jī)磷KH2PO4和有機(jī)磷PC的降解性能。當(dāng)初始KH2PO4濃度為60 mg/L時(shí)，Micrococcus NT_1001對(duì)KH2PO4的分解率最高;當(dāng)初始PC濃度為10 g/L時(shí)，GPC收率最高。

盡管如此，無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷都對(duì)Micrococcus NT_1001具有底物抑制作用。

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