符姜燕　侯冶海　劉善策　滑歡歡　趙紅娟　梁帆

摘 要：從低生物胺醬醪中篩選出1株嗜鹽四聯(lián)球菌，經(jīng)2號濾紙過濾及鏡檢證實，該菌株是以幾個細胞連接的狀態(tài)進行生長繁殖，在整個生長過程中不產(chǎn)生生物胺，用于醬油釀造中可大大減少醬油二次沉淀的生成量，亦可提高醬油生物安全性。因此，在醬醪發(fā)酵階段添加嗜鹽四聯(lián)球菌，是解決國產(chǎn)醬油二次沉淀和生物胺問題的有效手段。

關(guān)鍵詞：醬油;乳酸菌;沉淀;生物胺

中圖分類號 TS264.21文獻標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）12-0101-04

Abstract： In this study， a strain of T. halophilus was screened from the low-biological amine sauce mash. Filtering and microscopic examination of No. 2 filter paper confirmed that the strain was growing and multiplying with several cells connected; the strain did not Bio-amines are produced and used in soy sauce brewing， which can greatly reduce the amount of secondary precipitation of soy sauce， and can also improve the safety of bio-amines in soy sauce.

Key words：Soy sauce; Lactic acid bacteria; Sediment; Biogenic amine

醬油在調(diào)味品行業(yè)中占有重要地位，在呈香、味、色方面已具有其他調(diào)味品不可替代的功能。醬油釀造是以源自大豆和小麥的植物蛋白質(zhì)及碳水化合物為主要原料，生產(chǎn)涉及到多種有益微生物的聯(lián)合協(xié)同作用。其中最重要的是乳酸菌和酵母菌，它們主要作用是發(fā)酵糖類產(chǎn)生醇、醛、酸、酯、酚類等風(fēng)味物質(zhì)。其中乳酸菌是醬油發(fā)酵醪中主要的微生物，在發(fā)酵過程中，耐鹽性乳酸菌產(chǎn)生乳酸、乙酸等種類豐富的有機酸，從而使整個發(fā)酵體系的pH值開始下降，當(dāng)發(fā)酵體系的pH值下降至適宜酵母菌生長繁殖的時候，耐鹽酵母菌便開始大量生長繁殖，生產(chǎn)以醇類為主的各種小分子物質(zhì)，賦予醬油特有的醇味，同時大量的醇類物質(zhì)與有機酸發(fā)生酯化反應(yīng)產(chǎn)生酯類等風(fēng)味物質(zhì)，賦予醬油特有的風(fēng)味。

乳酸菌（Lactic acid bacteria， LAB）是一類能利用可發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸的細菌統(tǒng)稱，有球菌、桿菌之分。發(fā)酵醬油中添加乳酸菌，不僅能提高醬油的營養(yǎng)價值，還可改善醬油的風(fēng)味。目前，國內(nèi)外對乳酸菌用于醬油后發(fā)酵以促進醬油香氣和風(fēng)味形成的研究很多，崔瑞迎等將耐鹽乳酸菌用于高鹽稀態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)醬醪中2-甲基丁酸、2-甲基丁醇、乙酸異戊酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別較對照組高53.4%、337.3%、388.2%。嚴(yán)留俊對乳酸菌增加醬油風(fēng)味進行了探討性研究，確定了多菌種混合順序變溫發(fā)酵法進行醬油發(fā)酵的可行性。劉卓研究了添加耐鹽乳酸菌與醬醪中的酵母的協(xié)同作用，以及耐鹽乳酸菌對發(fā)酵工藝的控制和對醬油主要風(fēng)味的影響。結(jié)果表明，在醬醪發(fā)酵過程中，添加耐鹽乳酸菌明顯促進T酵母的生長，而與S酵母存在著相互促進的關(guān)系。結(jié)合廣式高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的工藝特點與乳酸菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)及乳酸菌的代謝產(chǎn)物對乳酸菌進行更深層次的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌種類中的嗜鹽片球菌在醬醪中是以多個細胞集聚存在的，半成品原油過濾后（燭式過濾器），可去除大部分乳酸菌菌體，從而減少貨架期醬油的二次沉淀。經(jīng)研究表明，一些乳酸菌可進一步分解醬醪中的酪氨酸、組氨酸等氨基酸態(tài)氮生成生物胺等有害物質(zhì)，影響醬油口感，危害人體健康。

筆者選取低生物胺醬醪進行耐鹽乳酸菌的分離，并根據(jù)其細胞形態(tài)、代謝產(chǎn)物等篩選出適用于醬油釀造的乳酸菌菌株，以解決醬油行業(yè)普通存在的二次沉淀難題，降低醬油中有毒有害物質(zhì)含量，提高醬油品質(zhì)及風(fēng)味。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料 釀造醬油生產(chǎn)原料：黃豆、面粉、麩皮，從市場采購。曲霉：廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司菌種庫提供。醬醪：廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司中山廠區(qū)所得，生物胺含量≤ 200mg/mL的發(fā)酵45d左右的醬醪;生物胺標(biāo)準(zhǔn)品（腐胺、尸胺、組胺、酪胺、色胺、苯乙胺、精胺、亞精胺）、乙酸鈉、乙氰、三乙胺、CuSO4、亞甲基藍、酒石酸鉀、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、AgNO3、NaOH、四硼酸鈉、Na2HPO4等均為分析純，購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司;L-組氨酸鹽酸鹽、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸鹽酸鹽、溴甲酚紫、磷酸吡哆醛，均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備 高效液相色譜儀：美國Waters分析儀器有限公司;Kjeitec2300凱氏定氮儀：瑞典FOSS分析儀器有限公司;WFZ UV-2100紫外分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司;H1850R臺式高速冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司;5415D高速離心機：德國艾本德股份公司;FE20實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配方 MRS培養(yǎng)基（g/L）：酪蛋白胨10、牛肉浸取物10、酵母提取物5、葡萄糖20、乙酸鈉5、檸檬酸二胺2、吐溫80 1、磷酸氫二鉀2、七水硫酸鎂0.2、七水硫酸錳0.05、氯化鈉100，pH6.8，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

液體脫羧酶固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨酵母抽提物5.0、酵母粉5.0、牛肉膏5.0、葡萄糖0.5、氯化鈉100、檸檬酸銨2.0、磷酸氫二鉀2.0、MnSO4 0.2、FeSO4 0.04、碳酸鈣0.3、磷酸吡哆醛1.0、溴甲酚紫0.06、賴氨酸5.0、鳥氨酸鹽酸鹽5.0、L-組氨酸鹽酸鹽2.0、色氨酸2.0、酪氨酸1.0、pH5.3，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

固體脫羧酶培養(yǎng)基（g/L）：瓊脂粉20，其他成分同液體脫羧酶培養(yǎng)基，pH5.3，121℃高壓蒸汽滅菌10min。

1.3 乳酸菌分離純化

1.3.1 乳酸菌富集培養(yǎng) 取低生物胺醬醪10g，接種于100mL高鹽MRS液體培養(yǎng)基中，32.5℃培養(yǎng)5d。

1.3.2 不產(chǎn)生物胺乳酸菌初篩 將富集培養(yǎng)后的菌液用無菌生理鹽水進行稀釋，取不同梯度的稀釋液100μL于固體脫羧酶培養(yǎng)基上進行涂布，于32.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，挑取黃色或白色陰性菌落并編號，多次劃線純化后接種于液體MRS培養(yǎng)基，于32.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后置于4℃冰箱保存。

1.3.3 高效液相色譜復(fù)篩 將初篩菌株接種于液體脫羧酶培養(yǎng)基中，32.5℃培養(yǎng)5d，對其發(fā)酵液進行HPLC檢測。

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。準(zhǔn)確稱取生物胺各50mg，用丙酮配制成1mg/mL的儲備液備用。分別取以上標(biāo)準(zhǔn)品儲備液1mL，用丙酮配制成最終濃度分別為1.0、2.5、5.0、10、15、25、50mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，鋁箔包住，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的前處理。取1mL各梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL離心管中，加入1mL丹黃酰氯溶液、1mL飽和NaHCO3溶液，渦旋混勻，60℃水浴30min，每隔10min開蓋放氣搖勻。待溶液溫度降至室溫后，加入100μL氨水，混勻，60℃水浴15min，取出冷卻至室溫。向其中加入3mL乙醚進行萃取，待渦旋混勻后靜置1h，吸取上層有機層于新的離心管中，向下層溶液中重新加入3mL乙醚，重新萃取2次。對所收集的上層液進行60℃吹氮，待吹干后，向離心管中加入1mL乙腈，晃動使乙腈充分接觸離心管壁，用0.22μL的有機膜過濾[10]。

（3）樣品的前處理。把培養(yǎng)5d的液體脫羧酶培養(yǎng)液進行12000r/min離心10min，取1mL上清液加入10mL離心管中，再加入1mL丹黃酰氯溶液、1mL飽和NaHCO3溶液，進行衍生。衍生、萃取步驟同標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（4）色譜分析。色譜條件：GEMINI C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，美國phenomenex公司），檢測波長254nm，進樣量20μL，柱溫30℃，流速1mL/min。流動相A為超純水，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序為：0～1min，B=65%（體積分?jǐn)?shù)）;1～10min，B=80%（體積分?jǐn)?shù)）;10～15min，B=90%（體積分?jǐn)?shù)）;15～25min，B=90%（體積分?jǐn)?shù)）;25～30min，B=65%（體積分?jǐn)?shù)），外標(biāo)法定量。

1.3.4 依據(jù)菌體形態(tài)進行復(fù)篩 高鹽MRS培養(yǎng)液，通過顯微鏡觀察菌落形態(tài)，并通過2號濾紙過濾，對比過濾前后菌液的澄清度。

1.3.5 適于醬油釀造的菌株16S rDNA鑒定篩選 該步驟由廣東省微生物研究中心完成，并給出檢測報告，確定該菌株的種屬。

1.3.6 乳酸菌的應(yīng)用 將不產(chǎn)生物胺且通過2號濾紙過濾澄清的菌株應(yīng)用于醬油釀造中，跟進發(fā)酵結(jié)束后醬油的生物胺含量及二次沉淀的含量。具體步驟為：（1）實驗室規(guī)模制作大曲：蒸熟的黃豆與面粉按照1∶0.4比例混合，接種米曲霉3.042，裝入鋁飯盒中于30℃恒溫培養(yǎng)44h，制得成熟的大曲。（2）實驗室規(guī)模制醪：150g大曲與450g濃度為25%的鹽水混合制成醬醪，裝于1L三角瓶中。（3）將擴大培養(yǎng)好的菌株擴培液分別添加至醬醪中，使得每瓶醬醪中的細胞數(shù)達到106 CFU/mL，以不添加菌株的醬醪為對照樣。（4）將混有菌株的醬醪放置在30℃培養(yǎng)箱，恒溫發(fā)酵30d，每10d檢測上清液的pH。發(fā)酵完成后，送檢水黃中組胺和酪胺的含量，進而判斷菌株產(chǎn)生物胺的能力，同時留樣觀察減少二次沉淀的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體脫羧酶培養(yǎng)基初篩 通過脫羧酶固體培養(yǎng)基平板顯色試驗進行不產(chǎn)生物胺乳酸菌的初步篩選，如圖1所示，顯色培養(yǎng)基上的菌落顏色有紫色、白色和黃色。根據(jù)平板顯色原理，由于生物胺為堿性物質(zhì)，因此產(chǎn)生物胺菌的菌落會使指示劑變?yōu)樽仙?，不產(chǎn)生物胺菌的菌落為黃色，通過平板初次篩選得到26株疑似不產(chǎn)生物胺的乳酸菌，編號分別為M1～M26。

2.2 HPLC檢測復(fù)篩 為了確認初步篩選到的26個陰性菌株是否為不產(chǎn)生物胺的菌株，采用HPLC法檢測26個菌株發(fā)酵液中的生物胺含量，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，通過HPLC法檢測，有3株菌（編號為M3、M6、M26）均不產(chǎn)生生物胺，有15株只產(chǎn)生組胺，有8株產(chǎn)生組胺和酪胺2種生物胺。

2.3 細胞形態(tài)復(fù)篩 分析醬油二次沉淀形成的主要原因為微生物菌體，結(jié)合醬油生產(chǎn)工藝可以得出，菌體細胞抱團生長（4個或者8個細胞連接在一起）的菌株在二次沉淀方面有一定的作用，因此采用2號濾紙過濾菌液，過濾后澄清的菌株適用于醬油釀造。編號為M3、M6、M26的菌株顯微鏡細胞形態(tài)及過濾前后的結(jié)果如圖2所示。

如圖2所示，菌株M6細胞是不集聚生長，濾液經(jīng)過過濾后仍然渾濁;菌株M3細胞是不集聚生長，過濾后的濾液雖然較未過濾前澄清，但仍有少量渾濁不透明，M26菌株細胞是集聚生產(chǎn)，菌液經(jīng)過過濾后，濾液澄清透明。通過上述2次篩選后，M26菌株不產(chǎn)生物胺且2號濾紙過濾后澄清透明，該菌株可以用于醬油釀造，因此將該菌株進行分子鑒定，確定其種屬。

2.4 16S rDNA鑒定結(jié)果 經(jīng)16S rDNA鑒定，菌株M26為嗜鹽四聯(lián)球菌。該菌株分解糖類物質(zhì)，產(chǎn)生有機酸，提高醬油風(fēng)味，且細胞形態(tài)為集聚生長，可大大減少醬油二次沉淀的生成量。

2.5 乳酸菌應(yīng)用效果 由表2、3可知，在醬油發(fā)酵期間添加嗜鹽四聯(lián)球菌M26，發(fā)酵結(jié)束后添加M26菌種的醬油生物胺較未添加的減少80.3%，添加M26后醬油二次沉淀析出時間校未添加的晚15d，且放置60d時試驗樣醬油二次沉淀減少89.56%。說明在醬油發(fā)酵期間添加M26菌種，可以減少醬油中的二次沉淀，同時降低天然油中生物胺含量。

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，從低生物胺醬醪中分離得到1株嗜鹽四聯(lián)球菌M26，其細胞形態(tài)為集聚生長，可大大減少醬油二次沉淀的生成量，改善了醬油外觀品質(zhì);該菌株不產(chǎn)生生物胺，將其添加到醬油發(fā)酵醬醪中可降低醬油生物胺的含量，提高了醬油生物安全性;該菌株分解糖類物質(zhì)，產(chǎn)生有機酸，在一定程度上能改善醬油風(fēng)味。下一步將對該嗜鹽四聯(lián)球菌改善醬油二次沉淀的機理及其在醬油大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用進行深入研究。

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（責(zé)編：徐世紅）