金喜新 王宏亮 陳海濤

摘要 [目的]了解河南省部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的感染情況，以便更好地掌握該病的流行現(xiàn)狀。[方法]應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）對(duì)來(lái)自河南省12個(gè)不同地區(qū)的250個(gè)疑似PCV2感染送檢樣品進(jìn)行檢測(cè)。[結(jié)果]總體陽(yáng)性率為91.20%。河南東部、西部、南部、北部、中部地區(qū)部分養(yǎng)豬場(chǎng)PCV2的陽(yáng)性率分別為81.82%、90.70%、89.66%、96.30%和93.75%。不同規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)的PCV2陽(yáng)性率也存在差異，大型養(yǎng)豬場(chǎng)、中型養(yǎng)豬場(chǎng)、小型養(yǎng)豬場(chǎng)的PCV2陽(yáng)性率分別為94.19%、92.68%和86.59%。[結(jié)論]豬圓環(huán)病毒2型在河南省已經(jīng)普遍流行，應(yīng)引起足夠的重視，各養(yǎng)豬場(chǎng)也應(yīng)采取相應(yīng)的防控措施：優(yōu)化斷奶仔豬的飼養(yǎng)環(huán)境;堅(jiān)持自繁自養(yǎng)和全進(jìn)全出的飼養(yǎng)模式;加強(qiáng)對(duì)豬群的飼養(yǎng)管理;認(rèn)真落實(shí)防疫工作;感染較嚴(yán)重的病豬予以淘汰，感染較輕的病豬隔離飼養(yǎng)。

關(guān)鍵詞 豬圓環(huán)病毒2型;PCR;調(diào)查;防控防疫

Abstract [Objective]To understand the infection situations of porcine circovirus type 2 in some areas of Henan Province，and better grasp the current status of the disease.[Method] Polymerase chain reaction （PCR） assay was used to detect 250 samples suspected of PCV2 infection from 12 different areas of Henan Province.[Result]The overall positive rate was 91.20%.The positive rates of PCV2 were 81.82%，90.70%，89.66%，96.30% and 93.75% receptively in eastern，western，southern，northern and central part of Henan swine farms.PCV2 positive rates in large pig farms，medium pig farms and small pig farms were 94.19%，92.68% and 86.59%，respectively.[Conclusion]The porcine circovirus type 2 has been wide prevalent in Henan Province.Swine farms should take corresponding preventive measures to prevent PCV2，by optimizing the feeding environment of weaned piglets，persisting in the breeding mode feeding，strengthening the management of pig breeding，conscientiously implementing epidemic prevention work.Pigs infected with more serious diseases should be eliminated，and pigs infected with less severe diseases should be kept in isolation.

Key words Porcinecircovirus type 2;PCR;Investigation;Prevention and control of disease

豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬、單股環(huán)狀無(wú)囊膜DNA病毒[1]。目前報(bào)道的豬圓環(huán)病毒可分為PCV1、PCV2、PCV3三個(gè)基因型。PCV1在豬群中廣泛存在，對(duì)豬沒有致病作用，可在PK15細(xì)胞系增殖但不產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE）[2]。PCV2對(duì)豬群具有廣泛的致病性[3]，可引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）[4]，豬繁殖障礙（reproductive disorders）、豬皮炎與腎病綜合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、仔豬先天性震顫（congenital tremor，CT）等，這一系列的臨床表現(xiàn)統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（porcine circovirusassociated disease ，PCVAD）[5]。2001年，我國(guó)報(bào)道豬群中存在PCV2感染[6]，且蔓延至很多省市。近年來(lái)，PCV2引起的PCVAD在我國(guó)的發(fā)生與流行呈上升趨勢(shì)，已成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。2016年，美國(guó)科學(xué)家Phan和Palinski幾乎同時(shí)報(bào)道了一個(gè)新的PCV基因型，即PCV3[7-8]。PCV3最早是從發(fā)生PMWS等病癥的母豬或仔豬體內(nèi)檢測(cè)出來(lái)，且同時(shí)發(fā)現(xiàn)病豬PCV2檢測(cè)呈陰性。2017年我國(guó)首次在廣東省的發(fā)病豬群中檢測(cè)到PCV3[9]。

目前，豬圓環(huán)病毒病已成為對(duì)生豬養(yǎng)豬業(yè)威脅最大的傳染病之一。河南省是生豬養(yǎng)殖大省，每年出欄大量的生豬，然而因?yàn)樵摬〉挠绊?，每年都?huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約著河南省生豬養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。為了解河南省PCV2的感染情況，以便更好地實(shí)施動(dòng)物疫病防控工作，筆者通過(guò)建立PCR方法在河南多地豬場(chǎng)進(jìn)行了PCV2流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 來(lái)自河南省12個(gè)不同地區(qū)的疑似PCV2感染的250份送檢樣品，包括脾、肺、肝、腎、扁桃體及腹股溝淋巴結(jié)組織樣品。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

利用基因分析軟件Primer Premier 5.0，參照GenBank中的PCV2基因序列（登錄號(hào)AF055391）設(shè)計(jì)1對(duì)PCV2特異引物。PCV487F為5′-CTGTTTTCGAACGCAGTGCC-3′;PCV487R6為5′-GCATCTTCAACACCCGCCT-3′。該引物可特異性擴(kuò)增出487 bp大小的基因片段，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 病料處理與DNA提取

采集病料中脾、肺、肝、腎、扁桃體及腹股溝淋巴結(jié)組織，加入PBS液稀釋并充分研磨，反復(fù)凍融3次，6 000 r/min，離心5 min，取上清液至滅菌離心管中，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。按照病毒核酸提取試劑盒操作步驟提取病毒DNA，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增

以提取的病毒DNA為模板，用1對(duì)PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物濃度為20 pmol/μL，dNTPs濃度為2.5 mmol/L，MgCl2濃度為25 mmol/L，rTaq酶為5 U/μL，整個(gè)PCR反應(yīng)體系為50 μL。PCR反應(yīng)體系如下：10× Buffer 5 μL，dNTPs 5 μL，MgCl2 4 μL，引物各1 μL，模板DNA 10 μL，rTaq酶0.5 μL，加超純水至50 μL，然后瞬時(shí)離心，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃45 s，58 ℃45 s，72 ℃45 s，共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果

運(yùn)用PCV2檢測(cè)引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽(yáng)性樣品能夠擴(kuò)增出487 bp 特異性條帶，其中部分瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。由表1可知，在采集的250份病料中，228份樣品呈PCV2陽(yáng)性，陽(yáng)性率為91.20%。

2.2 不同地區(qū)的樣品檢測(cè)結(jié)果

將12個(gè)不同地區(qū)送檢的250份樣品按照河南省東部（商丘市、周口市）、西部（南陽(yáng)市）、南部（駐馬店市、信陽(yáng)市）、北部（焦作市、新鄉(xiāng)市等）、中部（開封市、禹州市）劃分為5部分，結(jié)果顯示河南省東、西、南、北部、中部地區(qū)部分養(yǎng)豬場(chǎng)的PCV2陽(yáng)性率分別為81.82%、90.70%、89.66%、96.30%和93.75%。其中北部地區(qū)部分生豬養(yǎng)殖場(chǎng)PCV2的陽(yáng)性率最高，為96.30%;東部部分生豬養(yǎng)殖場(chǎng)的PCV2陽(yáng)性率最低，為81.82%（表2）。

2.3 不同規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)的樣品檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)不同養(yǎng)豬場(chǎng)年出欄商品肉豬量的不同將其劃分為大型養(yǎng)豬場(chǎng)（10 000頭以上）、中型養(yǎng)豬場(chǎng)（3 000～5 000頭）、小型養(yǎng)豬場(chǎng)（3 000頭以下）。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示不同規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)的PCV2陽(yáng)性率存在差異，大型養(yǎng)豬場(chǎng)、中型養(yǎng)豬場(chǎng)、小型養(yǎng)豬場(chǎng)的PCV2陽(yáng)性率分別為94.19%、92.68%和86.59%。其中大型養(yǎng)豬場(chǎng)的PCV2陽(yáng)性率最高，為94.19%;小型養(yǎng)豬場(chǎng)的PCV2陽(yáng)性率最低，為86.59%（表3）。

3 結(jié)論與討論

此次PCV2樣本檢測(cè)結(jié)果表明，河南省部分規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)PCV2的陽(yáng)性率為91.2%。2009年，胡慧等[10]在河南省采集226份豬血樣，應(yīng)用ELISA方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明PCV2的陽(yáng)性率為53.10%。此次調(diào)查PCV2的陽(yáng)性率顯著高于53.10%，此次調(diào)查樣本的來(lái)源全部為疑似發(fā)病的病豬，此次樣品來(lái)源為健康豬群，但都檢測(cè)出PCV2陽(yáng)性樣品。究其原因，可能與PCV2在豬群中感染率較高有關(guān)，但因病毒含量不高，并未使感染豬表現(xiàn)出典型的臨床癥狀，也可能與豬群中是否存在豬繁殖與呼吸綜合癥、豬偽狂犬病、豬瘟等其他免疫抑制病的流行有關(guān)[11]。

河南省不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)PCV2的陽(yáng)性率存在差異，這與2012—2013年馬少?gòu)?qiáng)等[12]在河南省不同地區(qū)采集的338份樣品檢測(cè)結(jié)果相同，PCV2在河南省已經(jīng)普遍流行，但部分養(yǎng)豬場(chǎng)戶的防控意識(shí)相對(duì)薄弱，導(dǎo)致該病毒在該地區(qū)大肆傳播。不同類型的養(yǎng)豬場(chǎng)PCV2的陽(yáng)性率也有差異，但都較高，這可能與飼養(yǎng)管理過(guò)程中操作不夠規(guī)范、生物安全意識(shí)不強(qiáng)、疫苗防疫措施落實(shí)不到位等有關(guān)。

4 PCV2的防控措施

因?yàn)镻CV2目前尚無(wú)特效的治療方法，要防控PCV2就必須以預(yù)防為主，采取綜合性防治措施，將PCV2的危害降低至最小。

4.1 加強(qiáng)對(duì)斷奶仔豬的飼養(yǎng)管理 防控豬圓環(huán)病毒病的有利時(shí)期主要在仔豬斷奶后的3～4周齡，此段時(shí)期，養(yǎng)豬場(chǎng)對(duì)斷奶后仔豬進(jìn)行疫苗接種、轉(zhuǎn)欄、并群、分群以及更換飼料、閹割等飼養(yǎng)管理操作工作，這些工作都是斷奶仔豬產(chǎn)生應(yīng)急刺激的主要因素。因此，在PCV2感染比較嚴(yán)重的養(yǎng)豬場(chǎng)，建議延遲仔豬斷奶至30日齡左右。斷奶時(shí)，應(yīng)保持仔豬原地不動(dòng)，母豬遷移出哺乳舍，并保證仔豬圈舍內(nèi)有充足的水和飼料供給，以減少豬群之間的相互打斗，盡可能減少對(duì)仔豬產(chǎn)生的應(yīng)激，也減少了PCV2在不同豬群中的傳播。仔豬斷奶后的10 d內(nèi)，最好不要更換飼料，加強(qiáng)對(duì)豬群的飼養(yǎng)管理，注意圈舍的通風(fēng)、溫度控制，加強(qiáng)環(huán)境消毒工作。對(duì)仔豬的疫苗接種以及閹割等最好在斷奶后7～10 d內(nèi)分開進(jìn)行，避免上述2項(xiàng)工作對(duì)仔豬一次性刺激過(guò)強(qiáng)。在疫苗接種時(shí)，應(yīng)注意周邊養(yǎng)豬場(chǎng)的疫病流行情況做出相應(yīng)的防疫措施，防止過(guò)早或多次對(duì)仔豬進(jìn)行免疫接種，盡可能減少對(duì)仔豬的不良刺激。

4.2 堅(jiān)持自繁自養(yǎng)和全進(jìn)全出的飼養(yǎng)模式 養(yǎng)豬場(chǎng)如果經(jīng)常引進(jìn)不同品種的種豬，由于個(gè)體健康狀態(tài)和免疫力不同，將會(huì)使種豬群的免疫狀態(tài)出現(xiàn)波動(dòng)，加上可能會(huì)因?yàn)槟硞€(gè)環(huán)節(jié)操作的疏忽大意而將含有隱性感染的種豬引進(jìn)種豬場(chǎng)，從而使病原菌在種豬群中蔓延擴(kuò)散，或許爆發(fā)其他一系列的疫病，而這一系列的疫病反過(guò)來(lái)又會(huì)使PCV2的疫情加重。綜上所述，經(jīng)常引進(jìn)不同品種的種豬也是使養(yǎng)豬場(chǎng)PCV2以及其他相關(guān)綜合征加重或爆發(fā)的一個(gè)危險(xiǎn)因素[13]，因此，建議養(yǎng)豬場(chǎng)應(yīng)盡量減少外來(lái)種豬的引進(jìn)，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)的飼養(yǎng)模式，這樣可以使隱性病原菌感染的概率降到最低。同時(shí)，養(yǎng)豬場(chǎng)還應(yīng)對(duì)不同生長(zhǎng)階段的豬群采取全進(jìn)全出的飼養(yǎng)模式，利于減少豬群感染PCV2以及其他病原的機(jī)率。

4.3 加強(qiáng)豬群日常管理，提供良好的飼養(yǎng)環(huán)境 不同生長(zhǎng)階段的豬群營(yíng)養(yǎng)需求有較大差異，不同類型的飼料應(yīng)按照其功能性供給不同生長(zhǎng)階段的豬群，從而保證豬群的全面均衡的營(yíng)養(yǎng)需要，確保其正常的生長(zhǎng)發(fā)育。同時(shí)，對(duì)于飼料的品質(zhì)也要嚴(yán)格的把控，對(duì)于劣質(zhì)、發(fā)霉的飼料應(yīng)及時(shí)淘汰。在豬群的管理上，不同生長(zhǎng)階段的豬群應(yīng)分開圈養(yǎng)，不混群飼養(yǎng)，豬舍內(nèi)的環(huán)境應(yīng)保持對(duì)豬群生長(zhǎng)發(fā)育最有利的情形下，同時(shí)，應(yīng)對(duì)豬舍進(jìn)行定期消毒。豬舍在進(jìn)豬之前應(yīng)對(duì)豬舍進(jìn)行徹底的打掃和消毒工作，包括入口設(shè)置消毒池以及殺蟲滅鼠等工作。養(yǎng)豬場(chǎng)內(nèi)不養(yǎng)殖其他動(dòng)物（如貓、狗等），否則也會(huì)造成疾病的傳播。另外，在不同的季節(jié)應(yīng)對(duì)豬舍內(nèi)的溫度實(shí)施監(jiān)控，做好適當(dāng)?shù)慕禍鼗蛏郎毓ぷ?，同時(shí)應(yīng)保證豬舍的通風(fēng)、定時(shí)進(jìn)行氨氣檢測(cè)。養(yǎng)豬場(chǎng)應(yīng)建立獨(dú)立的糞污排放系統(tǒng)，集中收集糞污并進(jìn)行發(fā)酵處理。養(yǎng)豬場(chǎng)應(yīng)與周圍的環(huán)境隔離，對(duì)于外來(lái)人員、外來(lái)車輛和物品應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的消毒工作，有效切斷PCV2傳播途徑。

4.4 嚴(yán)格落實(shí)豬群的免疫接種 對(duì)于PCV2感染嚴(yán)重的養(yǎng)豬場(chǎng)，應(yīng)嚴(yán)格實(shí)施有計(jì)劃地疫苗免疫接種。仔豬在3～4周齡首免，間隔3周進(jìn)行加強(qiáng)免疫;后備母豬配種前做基礎(chǔ)免疫2次，產(chǎn)前一個(gè)月加強(qiáng)免疫1次;經(jīng)產(chǎn)母豬產(chǎn)前1個(gè)月免疫1次;公豬和其他成年豬實(shí)施普免，每半年免疫1次。按照制定的免疫程序?qū)ωi群進(jìn)行常規(guī)免疫接種后，應(yīng)定期采集豬群的血液樣本進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)工作，及時(shí)掌握疫苗接種的免疫效果。此外，還應(yīng)做好豬瘟、豬偽狂犬病、豬細(xì)小病毒病等其他常見疾病的基礎(chǔ)免疫工作，防止混合感染的發(fā)生。在實(shí)際生產(chǎn)中，也可以制備自家苗來(lái)預(yù)防PCV2，但制作和使用自家苗一定要嚴(yán)格按照規(guī)范流程進(jìn)行，避免給豬場(chǎng)帶來(lái)新的問(wèn)題[14]。

4.5 合理做好對(duì)已感染豬群的防治 由于PCV2現(xiàn)在還沒有特效的治療方法，因此各養(yǎng)豬場(chǎng)應(yīng)做好綜合性預(yù)防工作，除了日常的飼養(yǎng)管理、檢疫和消毒工作外，為了能更好地提高豬群的免疫力，可在飼料中適當(dāng)添加中藥作為添加劑，如黨參、白術(shù)等，對(duì)防控豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病有一定幫助[15]。對(duì)發(fā)病豬，視發(fā)病輕重情況，對(duì)其采取隔離飼養(yǎng)或無(wú)害化處理。對(duì)于一些發(fā)病癥狀較輕的病豬，應(yīng)予以隔離飼養(yǎng)。對(duì)于發(fā)病較為嚴(yán)重的病豬應(yīng)予以淘汰和無(wú)害化處理，避免對(duì)其他豬群造成感染。

參考文獻(xiàn)

[1] BASSAMI M R，BERRYMAN D，WILCOX G E，et al.Psittacine beak and feather disease virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus，plant circoviruses，and chicken anaemia virus [J].Virology，1998，249：453-459.

[2] CALSAMIGLIA M，SEGALS J，QUINTANA J，et al.Detection of porcine circovirus types 1 and 2 in serum and tissuesamples of pigs with and without postweaningmultisystemic wasting syndrome[J].J Clin Microbiol，2002，40（5）：1848-1850.

[3] OLVERA A，CORTEY M，SEGALS J.Molecular evolution of porcine circovirus type 2 genomes：Phylogeny and clonality[J].Virology，2007，357：175-185.

[4] HARDING J C，CLARK E G.Recognizing and diagnosing postweaningmultisystemic wasting syndrome （PMWS）[J].Swine health and production，1997，5：201-203.

[5] ALLAN G，KRAKOWKA S，ELLIS J A.PCV2：Ticking time bomb[J].Pig progress，2002，18：14-15.

[6] 郎洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)，等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測(cè)[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2000，30（3）：3-5.

[7] PHAN T G，GIANNITTI F，ROSSOW S，et al.Detection of a novel circovirus PCV3 in pigs with cardiac and multi-systemic inflammation[J].Virology journal，2016，13：1-8.

[8] PALINSKI R，PIEYRO P，SHANG P C，et al.A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure[J].Journal of virology，2016，91（1）：1-13.

[9] SHEN H，LIU X，ZHANG P，et al.Genome characterization of a porcine circovirus type 3 in South China[J].Transboundary and emerging diseases，2018，65（1）：264-266.

[10] 胡慧，王亞賓，陳麗穎，等.河南地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型感染的血清流行病學(xué)調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，42（10）：70-72.

[11] 徐樂樂，孟相秋，和彥良，等.豬圓環(huán)病毒病及其免疫預(yù)防[J].豬業(yè)科學(xué)，2016，33（11）：136-137.

[12] 馬少?gòu)?qiáng)，孫超，張幸幸，等.豬圓環(huán)病毒2型感染的血清學(xué)調(diào)查[J].當(dāng)代畜牧，2014（17）：71-72.

[13] 夏道倫，李淑萍.豬圓環(huán)病毒病的危害及其有效的防控措施[J].廣東飼料，2018，27（4）：47-50.

[14] 劉軍，吳洪濤，李鳳元.應(yīng)用自家組織滅活苗防制豬圓環(huán)病毒病的報(bào)告[J].養(yǎng)殖，2006（1）：45.

[15] 懷川，王茜，王升，等.豬圓環(huán)病毒相關(guān)?。≒CVAD）及其防治措施[J].中國(guó)畜禽種業(yè)，2013（3）：112.