袁雷　鐘政昌　劉瑜　胡瀟翎　錢康

摘要 [目的]優(yōu)化血滿草多糖的雙水相萃取工藝。[方法]通過考察K2HPO4濃度、PEG6000濃度和多糖濃度對血滿草葉多糖萃取率的影響，以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，使用響應(yīng)面法對血滿草多糖的雙水相萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化，模擬得到回歸模型。[結(jié)果]血滿草多糖的最佳雙水相萃取工藝為K2HPO4濃度29.09%、PEG6000濃度17.07%、多糖濃度26.21 mg/mL。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，血滿草多糖的實(shí)際萃取率為85.802 5%±0.739 3%，與模型預(yù)測值接近，兩者相對誤差為1.37%。[結(jié)論]該回歸模型可真實(shí)反映萃取條件對多糖萃取率的影響，為血滿草多糖的開發(fā)利用提供了重要的參考數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 血滿草;多糖;雙水相體系;萃取工藝;優(yōu)化;響應(yīng)面法

中圖分類號 R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2020）13-0179-04

Abstract [Objective] In order to optimize the aqueous twophase extraction process of polysaccharide from Sambucus adnate. [Method]The effects of K2HPO4 concentration， PEG6000 concentration and polysaccharide concentration on the extraction rate were investigated. Based on the single factor test results， the response surface method was used to optimize the aqueous twophase extraction process and a regression model was simulated. [Result]The optimal aqueous twophase extraction process of polysaccharides from Sambucus adnate was：the concentration of K2HPO4， PEG6000 and polysaccharide were 29.09%， 17.07% and 26.21 mg/mL， respectively. In the validation test， the actual extraction rate was 85.8025% ± 0.7393%， which was close to the predicted value of the model， and the relative error was 1.37%. [Conclusion]The regression model can truly reflect the influence of extraction conditions on the extraction rate of polysaccharide， and provide important reference data for the development and utilization of polysaccharide from Sambucus adnate.

Key words Sambucus adnate Wall.;Polysaccharide;Aqueous twophase extraction;Extraction process;Optimization;Response surface methodology

血滿草（Sambucus adnate Wall.）為忍冬科接骨木屬植物的干燥地上部分或全草，藥用全草或根皮，分布于西藏、四川、云南等省區(qū)，其味辛、甘、性溫，具有祛風(fēng)、利水、活血、通絡(luò)的功效，主治急慢性腎炎、風(fēng)濕疼痛、風(fēng)疹瘙癢、脊髓灰質(zhì)炎后遺癥、慢性腰腿疼、扭傷瘀痛、骨折等癥狀[1]。血滿草是我國民間常用藥，在藏、傣、彝、哈尼等少數(shù)民族中有著悠久的藥用歷史，并被記錄于各少數(shù)民族的藥書中[2]。

目前，國內(nèi)外對血滿草化學(xué)成分及生物活性的研究有一定的研究報(bào)道，但有關(guān)血滿草多糖的研究報(bào)道還很少[3]。隨著對多糖的生物活性越來越深入的研究，發(fā)現(xiàn)多糖具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗炎等多種生物活性[4-7]，使多糖逐漸成為當(dāng)今新藥開發(fā)的重要方向之一。

雙水相萃取法是一種新型萃取分離技術(shù)，它具有生物的相容性較好、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)[8]。目前，雙水相萃取技術(shù)已經(jīng)廣泛地運(yùn)用到各種生物有效成分的提取中，如酚類、蛋白質(zhì)和多糖等[9]。孟憲軍等[10]已經(jīng)運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化雙水相萃取技術(shù)萃取五味子多糖，結(jié)果表明雙水相萃取可以用于五味子多糖的提取。

血滿草在西藏分布較廣，資源量相對較大，但是利用率極低，尚未得到合理的開發(fā)利用，關(guān)于雙水相萃取血滿草多糖的相關(guān)研究也鮮見報(bào)道。該研究以血滿草葉片為材料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化血滿草多糖的雙水相萃取工藝，為血滿草的開發(fā)利用提供參考，也為后期開展血滿草多糖的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。血滿草（Sambucus adnate Wall.）采自西藏自治區(qū)林芝市巴宜區(qū)覺木溝。

1.1.2 主要試劑。所有試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器。722N紫外可見分光光度計(jì)（上海奧譜勒儀器有限公司）;L-550離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;LGJ0.5冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 血滿草多糖的制備。將血滿草葉片粉末分別用3倍體積石油醚和乙醇回流脫除脂溶性和醇溶性雜質(zhì);以純水作為提取劑，在提取溫度89 ℃、提取時間114 min、溶劑用量26 mL/g、提取4次條件下熱水浸提血滿草多糖。合并提取液，濃縮后加入無水乙醇至終濃度為80%，于4 ℃醇沉24 h，再經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取沉淀，加入少量純水復(fù)溶，冷凍干燥得到血滿草多糖。

1.2.2 血滿草多糖萃取率的計(jì)算。采用硫酸苯酚法測定雙水相體系中上下相的多糖濃度[11]。根據(jù)該法測定的雙水相上下相多糖濃度計(jì)算多糖的萃取率。

K=Ct/Cb（1）

R=Vt/Vb（2）

Y=1/（1+RK）（3）

式中，K為多糖在雙水相體系的分配系數(shù);R為雙水相體系上下相的體積比;Y為多糖的萃取率（%）;Ct為雙水相體系上相多糖的濃度（g/L）;Cb為雙水相體系下相多糖的濃度（g/L）;Vt為雙水相體系上相體積（mL）;Vb為雙水相體系下相體積（mL）。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。設(shè)定PEG分子量、K2HPO4濃度、PEG濃度和血滿草多糖濃度為因素，以多糖萃取率為考察指標(biāo)，考察除PEG分子量以外的3個因素對血滿草葉多糖萃取效果的影響。

1.2.3.1 PEG分子量對多糖萃取率的影響。K2HPO4濃度30%，PEG濃度15%，血滿草多糖濃度為25 mg/mL，雙水相體系為10 mL，分別考察PEG分子量為1 000、2 000、4 000、6 000、10 000和20 000 Da對血滿草葉多糖萃取效果的影響。

1.2.3.2 K2HPO4濃度對多糖萃取率的影響。PEG6000濃度15%，血滿草多糖濃度20 mg/mL，雙水相體系為10 mL，分別考察K2HPO4濃度為20%、25%、30%、35%、40%和45%時對血滿草葉多糖萃取率的影響。

1.2.3.3 PEG6000濃度對多糖萃取率的影響。K2HPO4濃度30%，血滿草多糖濃度20 mg/mL，雙水相體系為10 mL，分別考察PEG6000濃度為5%、10%、15%、20%、25%和30%對血滿草葉多糖萃取率的影響。

1.2.3.4 血滿草多糖濃度對多糖萃取率的影響。K2HPO4濃度30%，PEG6000濃度15%，水相體系為10 mL，分別考察血滿草多糖濃度為5、10、15、20、25、30和35 mg/mL對血滿草多糖萃取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取K2HPO4濃度、PEG6000濃度和血滿草多糖濃度3個因素為自變量，每個自變量的低、中、高水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，多糖萃取率為響應(yīng)值，使用Design Expert 8.0.5軟件對試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化多糖萃取工藝，中心組合試驗(yàn)的因素與水平見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。響應(yīng)曲面模型的回歸方程式和顯著性統(tǒng)計(jì)用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行計(jì)算和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相體系對多糖萃取率的影響

2.1.1 PEG分子量對多糖萃取率的影響。從PEG分子量對血滿草葉多糖萃取效果的影響（圖1）可以看出，K2HPO4對不同分子量的PEG均有良好的分相能力，但不同分子量的PEG對血滿草多糖萃取率有較大的變化，對于分子量較小的PEG來說分相能力弱于分子量較大的PEG，然而分子量過大的PEG溶液較為黏稠，不利于試驗(yàn)的下一步進(jìn)行，根據(jù)圖1，考慮多方面的因素，所以選擇萃取率較高的PEG6000作為PEG-K2HPO4雙水相體系的組成成分之一。

2.1.2 K2HPO4濃度對多糖萃取率的影響。從K2HPO4濃度對血滿草葉多糖萃取率的影響（圖2）可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著K2HPO4濃度的增加，K2HPO4濃度為35%時多糖的萃取率達(dá)到最高，隨著K2HPO4濃度質(zhì)量繼續(xù)增加，萃取率降低。因此K2HPO4濃度取35%效果較好。

2.1.3 PEG6000濃度對多糖萃取率的影響。

從圖3可以看出，在一定的范圍內(nèi)，隨著PEG6000濃度的增加，血滿草葉多糖的萃取率逐漸升高，PEG6000濃度增加至15%時，萃取率最大，隨后逐漸降低，可能是因?yàn)橄孪酀舛冗^高，導(dǎo)致上相體積減少，降低了萃取率。綜合各個方面的因素，最終選擇PEG6000濃度為15%。

2.1.4 多糖濃度對多糖萃取率的影響。從圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增加，多糖萃取率增加，多糖濃度增加至25 mg/mL時萃取率最大。因此，多糖濃度為25 mg/mL為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取K2HPO4濃度、PEG6000濃度和多糖濃度3個因素為自變量，多糖萃取率為響應(yīng)值，采用Design Expert軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過響應(yīng)面試驗(yàn)對多糖雙水相萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)方案和試驗(yàn)結(jié)果見表2。

應(yīng)用Design Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面方案，對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，得到多糖萃取率的多元回歸方程：Y=-108.142 0+6.589 7A+0.941 9B+6.962 8C-0.025 5AB+0.006 3AC+0.078 0BC- 0.108 6A2-0.065 7B2-0.161 7C2。利用Design Expert 8.0.5軟件對上述多元回歸模型進(jìn)行方差分析及顯著性統(tǒng)計(jì)和適合度檢驗(yàn)，F(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果表明模型具有極顯著性（P=0.000 2）;失擬度的F值為3.099 5，P值為0.151 5>005，失擬度不顯著，表明多元回歸模型能準(zhǔn)確反映3個因素對多糖萃取率的影響。調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.932 4>080，說明模型相關(guān)性高，用該模型模擬真實(shí)的3因素3水平的分析是可信的。因此，該模型可用于血滿草葉多糖雙水相萃取工藝試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析與預(yù)測。

運(yùn)用Design Expert軟件模擬生成3組等高線和響應(yīng)面圖，見圖5。從圖5可以看出，血滿草多糖濃度對多糖萃取率的影響最顯著，表現(xiàn)為曲線弧度較大;PEG6000濃度和K2HPO4濃度對多糖萃取率的影響較小，表現(xiàn)為曲線較平緩，但是也達(dá)到了顯著水平（P<0.05）。

通過Design Expert軟件，血滿草多糖的最優(yōu)萃取工藝為K2HPO4濃度29.09%、PEG6000濃度17.07%、多糖濃度2621 mg/mL，此時多糖萃取率預(yù)測值為86999 5%。為了方便操作，最優(yōu)萃取參數(shù)修正為K2HPO4濃度29%、PEG6000濃度17%、多糖濃度26 mg/mL，此時多糖萃取率預(yù)測值為86.992 2%。

為了驗(yàn)證模型方程是否適用，在參數(shù)修正的條件下，進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，最終得到實(shí)際多糖萃取率為85.802 5%±0.739 3%（n=3），兩者相對誤差為1.37%，說明通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論與討論

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)可在因素和響應(yīng)值之間建立模型，并且可以進(jìn)行擬合分析，從而篩選出的最佳參數(shù)工藝，克服了正交試驗(yàn)無法給出整體最佳的試驗(yàn)組合和響應(yīng)面的缺點(diǎn)[12]。此外，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對試驗(yàn)的預(yù)測性較好，且響應(yīng)面的三維圖能更直觀、方便地表達(dá)各個因素對指標(biāo)的影響，在中藥有效成分提取分離領(lǐng)域中將會越來越得到重視[13]。該試驗(yàn)采用PEG6000- K2HPO4雙水相體系萃取血滿草多糖，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明血滿草多糖的最佳萃取條件為K2HPO4濃度29.09%、PEG6000濃度17.07%、多糖濃度26.21 mg/mL，此時多糖萃取率預(yù)測值為86.999 5%。為了方便操作，最優(yōu)萃取參數(shù)修正為K2HPO4濃度29%、PEG6000濃度17%、多糖濃度26 mg/mL，此時多糖萃取率預(yù)測值為86.992 2%。

通過驗(yàn)證測試，血滿草多糖萃取率實(shí)際值為85.802 5%±0.739 3%（n=3），實(shí)際值與預(yù)測值兩者相對誤差較小，采用的非線性擬合模型也比較接近客觀的事實(shí)，說明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化而得到的模型參數(shù)較為準(zhǔn)確可靠，可以用于血滿草多糖的分離純化，為血滿草資源的開發(fā)利用提供了重要的參考數(shù)據(jù)。

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