巢靜波 王靜如 張靖其

摘要建立了基于單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜（SPICPMS）技術(shù)的金納米顆粒（AuNPs）數(shù)量濃度和粒徑的準(zhǔn)確測(cè)定方法， 考察了傳輸效率計(jì)算方式、駐留時(shí)間、稀釋試劑、進(jìn)樣方式等對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。傳輸效率對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確度影響較大， 應(yīng)根據(jù)測(cè)量目標(biāo)參數(shù)選擇傳輸效率計(jì)算方式， 并在測(cè)定過(guò)程中保持傳輸效率的穩(wěn)定， 利用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行校正。駐留時(shí)間的選擇直接影響結(jié)果的精確程度， 應(yīng)根據(jù)樣品類型、粒徑等性質(zhì)慎重選擇數(shù)據(jù)處理模式。當(dāng)駐留時(shí)間為0.1 ms時(shí)， 檢測(cè)30 nm和60 nm AuNPs的線性范圍分別為2～40 pg/g和10～200 pg/g， 線性相關(guān)系數(shù)大于0.9998， 數(shù)量濃度測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.80%， 顆粒數(shù)量濃度和粒徑的檢出限分別為110 NPs/g和9 nm。對(duì)合成的4種AuNPs和國(guó)際比對(duì)樣品分別進(jìn)行了測(cè)定， 國(guó)際比對(duì)樣品顆粒數(shù)量濃度結(jié)果與比對(duì)參考值偏差<5%， 測(cè)定結(jié)果等效一致， 擴(kuò)展不確定度<15% （k=2）， 進(jìn)一步驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確度和適用性。

關(guān)鍵詞顆粒數(shù)量濃度; 粒徑; 金納米顆粒; 單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜法

1引 言

近年來(lái)， 含有納米材料的產(chǎn)品逐步進(jìn)入市場(chǎng)且數(shù)量逐年增加[1]， 其中， 金納米顆粒（AuNPs）由于其獨(dú)特的表面效應(yīng)與小尺寸效應(yīng)， 廣泛用于生物標(biāo)記、藥物載體、癌癥治療等領(lǐng)域。AuNPs可在大鼠的肝臟、脾臟、腎臟大量積累[2]， 誘導(dǎo)DNA損傷并增加紅細(xì)胞核異常的頻率[3]。目前， 針對(duì)納米材料在生物體中作用機(jī)理的研究尚少， 其經(jīng)過(guò)環(huán)境及生物體內(nèi)的遷移轉(zhuǎn)化是否仍然安全尚需進(jìn)一步研究[4]， 主要的技術(shù)難點(diǎn)是缺乏有效的實(shí)際生物及環(huán)境樣品中痕量納米材料（ng/L級(jí)）的準(zhǔn)確定量和表征技術(shù)。因此， 可靠、準(zhǔn)確的復(fù)雜基體中納米材料的定量、追蹤和表征技術(shù)是納米科技風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的關(guān)鍵[5]。

納米材料的潛在風(fēng)險(xiǎn)引起了世界各國(guó)及區(qū)域組織的廣泛關(guān)注， 歐盟委員會(huì)在2011年對(duì)納米材料進(jìn)行了界定[6]， 即“天然、非目的性加入或者人工制造的含有非結(jié)合態(tài)、聚集或團(tuán)聚狀態(tài)的， 粒徑分布占50%以上， 有一維或多維尺度在1～100 nm范圍內(nèi)的材料”。另外， 歐盟也出臺(tái)了化妝品相關(guān)指令（EC 1223/2009）[7]， 規(guī)定在化妝品中使用的納米材料， 必須在標(biāo)簽中進(jìn)行標(biāo)識(shí)?？梢?jiàn)， 常規(guī)的濃度檢測(cè)已不能滿足相關(guān)要求， 還必須對(duì)納米材料的顆粒數(shù)量濃度、粒徑、粒徑分布、存在狀態(tài)等進(jìn)行檢測(cè)和表征。單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜（Single particleinductively coupled plasmamass spectrometry， SPICPMS）技術(shù)是近年出現(xiàn)的納米顆粒粒徑、顆粒數(shù)量濃度、質(zhì)量濃度和聚集狀態(tài)的分析方法[8～11]， 其結(jié)合了形態(tài)鑒別和定量分析雙重優(yōu)勢(shì)， 具有靈敏度高、直觀性強(qiáng)等特點(diǎn)[12]， 針對(duì)納米材料的定義有望成為相關(guān)法規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)方法。自Degueldre等[13]提出單顆粒分析的理論基礎(chǔ)以來(lái)， SPICPMS已用于廢水[14]、化妝品[15]、動(dòng)物組織[16]等基體中納米顆粒的測(cè)定， 對(duì)粒徑的測(cè)定可采用TEM進(jìn)行驗(yàn)證， 但對(duì)顆粒數(shù)量濃度仍缺乏有效的確認(rèn)方法。歐盟標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和測(cè)量研究院聯(lián)合研究中心（IRMM JRC）對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室采用SPICPMS測(cè)定納米銀粒徑、質(zhì)量濃度和顆粒數(shù)量濃度的結(jié)果進(jìn)行評(píng)估和考察[17]， 結(jié)果表明， 實(shí)驗(yàn)室間再現(xiàn)性較差， 需對(duì)該方法進(jìn)一步改進(jìn)。2015年， 美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）以AuNPs標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為樣品， 組織了實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)， 以評(píng)估SPICPMS方法對(duì)粒徑檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性、精密度、準(zhǔn)確度等方法性能參數(shù)[18]， 結(jié)果表明， 各實(shí)驗(yàn)室間對(duì)AuNPs粒徑的檢測(cè)結(jié)果一致， 但對(duì)于AuNPs顆粒數(shù)量濃度的測(cè)定仍存在一些困難， 有必要進(jìn)一步對(duì)顆粒數(shù)量濃度的準(zhǔn)確測(cè)定及相關(guān)不確定度來(lái)源進(jìn)行考察和分析。

為應(yīng)對(duì)相關(guān)指令和法規(guī)的實(shí)施， 2017年國(guó)際計(jì)量局物質(zhì)量咨詢委員會(huì)（CCQM）開(kāi)展了以AuNPs為目標(biāo)物的定量和表征方法國(guó)際研究型比對(duì)（CCQMP194）， 由英國(guó)政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室（LGC）主導(dǎo)， 該比對(duì)旨在評(píng)價(jià)多種方法檢測(cè)單分散AuNPs顆粒數(shù)量濃度的能力。本研究采用SPICPMS技術(shù)檢測(cè)AuNPs， 重點(diǎn)對(duì)儀器參數(shù)和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇和優(yōu)化， 分析傳輸效率計(jì)算方式對(duì)顆粒數(shù)量濃度和粒徑的影響， 建立基于化學(xué)手段的單分散AuNPs顆粒數(shù)量濃度和粒徑的準(zhǔn)確測(cè)定方法， 并以計(jì)量學(xué)手段開(kāi)展不確定度評(píng)定， 通過(guò)合成樣品和CCQM國(guó)際比對(duì)樣品的測(cè)定驗(yàn)證其準(zhǔn)確性和適用性。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

8800型及8900型三重四極桿電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（QQQICPMS， 美國(guó)安捷倫公司）， 配有數(shù)據(jù)采集及處理軟件（MassHunter Workstations）和單顆粒分析模塊; TEM（JEOL JEM2100F， Japan）; XP205型電子分析天平（瑞士MettleToledo公司）; 超純水機(jī)（美國(guó)MilliQ公司）; 50 mL石英瓶和聚丙

2.2SPICPMS相關(guān)原理

SPICPMS技術(shù)最初由Degueldre等[13]表征水溶液中膠體時(shí)提出，? Pace等[20]的工作證明了其表征納米顆粒的潛力。其原理為：在時(shí)間分辨（TRA）模式下， 離子云依次在檢測(cè)器產(chǎn)生脈沖信號(hào)， 脈沖信號(hào)數(shù)量與顆粒數(shù)量濃度成正比， 信號(hào)強(qiáng)度與顆粒質(zhì)量或粒徑成正比。Pace等[20]通過(guò)公式（1）計(jì)算納米顆粒數(shù)量濃度NNP （NPs/g）， 由公式（2）建立質(zhì)量強(qiáng)度曲線， 由納米顆粒強(qiáng)度信號(hào)值通過(guò)曲線信息求得顆粒質(zhì)量W （μg）， 計(jì)算方式見(jiàn)公式（3）。 假設(shè)納米顆粒為實(shí)心球形， 可根據(jù)公式（4）計(jì)算納米顆粒粒徑d （nm）。

3.3方法性能參數(shù)

3.3.1方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性配制10 pg/g RM 8012和25 pg/g RM 8013AuNPs分散液， 以RM 8012為標(biāo)準(zhǔn)， 重復(fù)測(cè)定7次， 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6， 粒徑結(jié)果與標(biāo)稱值吻合， RSD<1.5%。由不同駐留時(shí)間獲得的顆粒數(shù)量濃度的準(zhǔn)確度可知，? 0.1 ms駐留時(shí)間下的準(zhǔn)確度較3 ms有所提高， 與顆粒濃度理論計(jì)算值偏差<3%， 3 ms駐留時(shí)間可滿足常規(guī)實(shí)驗(yàn)要求。

3.3.2方法的線性關(guān)系配制不同濃度的RM 8012和RM 8013溶液， 重復(fù)測(cè)定3次，? 線性關(guān)系如圖5所示。對(duì)于30 nm樣品， 駐留時(shí)間為3 ms時(shí)， 在2～25 pg/g范圍內(nèi)， 顆粒數(shù)量濃度與質(zhì)量濃度的線性相關(guān)系數(shù)≥0.9998， 高于25 pg/g時(shí)， 標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)彎曲; 駐留時(shí)間為0.1 ms時(shí)， 線性范圍上限可擴(kuò)展到40 pg/g。對(duì)于60 nm樣品， 駐留時(shí)間為3和0.1 ms時(shí)， 在10～200 pg/g范圍內(nèi)， 顆粒數(shù)量濃度與質(zhì)量濃度的線性相關(guān)系數(shù)均為0.9999。

3.3.3方法的檢出限SPICPMS的粒徑檢出限（LODd） [24]和顆粒數(shù)量濃度檢出限（LODNP）[25]， 可由公式（7）和（8）分別求出：

其中， ρ為納米顆粒的密度， XM為納米顆粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)， KICPMS為檢測(cè)效率（檢測(cè)到的離子與進(jìn)入ICP離子的比值）， KM =ANAV/mM， 其中A為原子的同位素豐度， NAV為阿伏伽德羅常數(shù)， MM為原子質(zhì)量， ti為采樣時(shí)間。 除了溶解態(tài)離子或背景對(duì)粒徑檢出限的影響外， 還包括檢測(cè)效率的影響， 該參數(shù)取決于具體的測(cè)定儀器。由公式（8）可知， 顆粒數(shù)量濃度的檢出限與傳輸效率、樣品流速和采集時(shí)間有關(guān)。經(jīng)計(jì)算， 顆粒數(shù)量濃度的檢出限為110 NPs/g， 粒徑檢出限為9 nm。

3.4樣品分析結(jié)果

采用本方法分別測(cè)定比對(duì)樣品和合成樣品， 結(jié)果見(jiàn)表7。合成AuNPs的粒徑結(jié)果與TEM表征結(jié)果偏差在Symbolm@@4.5～4.5 nm之間（圖6）， 國(guó)際比對(duì)樣品粒徑測(cè)定結(jié)果與30 nm的標(biāo)稱值基本一致; 顆粒數(shù)量濃度的測(cè)定結(jié)果與關(guān)鍵比對(duì)參考值偏差<5%， 在比對(duì)參考不確定度范圍內(nèi)， 測(cè)定結(jié)果等效一致。

4結(jié) 論

建立了一種準(zhǔn)確測(cè)定單分散AuNPs顆粒數(shù)量濃度和粒徑的方法， 考察了傳輸效率計(jì)算方式、駐留時(shí)間、稀釋試劑等對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。以顆粒數(shù)量計(jì)算傳輸效率的方式測(cè)定顆粒數(shù)量濃度， 駐留時(shí)間為0.1和3 ms時(shí)， 偏差<3%， 滿足常規(guī)實(shí)驗(yàn)需求。采用本方法對(duì)合成的4種粒徑AuNPs和CCQMP194比對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定， 顆粒數(shù)量濃度檢測(cè)結(jié)果與理論值和關(guān)鍵比對(duì)參考值吻合， 粒徑檢測(cè)結(jié)果與TEM結(jié)果一致。國(guó)際比對(duì)顆粒數(shù)量濃度的檢測(cè)結(jié)果等效一致， 擴(kuò)展不確定度<15%， 與歐美國(guó)家計(jì)量機(jī)構(gòu)不確定水平相當(dāng)。本研究采用化學(xué)手段進(jìn)行AuNPs顆粒數(shù)量濃度國(guó)際研究型計(jì)量比對(duì)， 評(píng)估了方法的性能參數(shù)和不確定度水平， 可為其它典型金屬納米顆粒的準(zhǔn)確測(cè)定和表征提供參考。

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