李丹陽(yáng) 楊恒達(dá) 王新衛(wèi)

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州450002

馬立克氏病（marek’s disease，MD）是最常見(jiàn)的一種雞淋巴組織增生性傳染病，以外周神經(jīng)和包括虹膜、皮膚在內(nèi)的各種器官和組織的單核性細(xì)胞浸潤(rùn)為特征。該病傳染性強(qiáng)，常給家禽生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失。禽白血病（avian leukosis，AL）是由禽白血病/肉瘤病毒群中的病毒引起的禽類的多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，在自然條件下以淋巴白血病最為常見(jiàn)，世界各地均有本病存在，大多數(shù)雞群均有感染，但出現(xiàn)臨診癥狀的病雞數(shù)量較少[1]。ALV 有2 種傳播方式：水平傳播和垂直傳播。大多數(shù)雞通過(guò)與先天感染雞的密切接觸獲得感染，從而給后來(lái)的生產(chǎn)帶來(lái)不可估量的損失[2-3]。網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（reticuloendotheliosis virus，REV）屬哺乳動(dòng)物C 型反轉(zhuǎn)錄病毒屬，只有1 個(gè)血清型，除引發(fā)腫瘤外，常在感染雞群中引起嚴(yán)重的免疫抑制或免疫耐受[4]。這3 種病毒在生產(chǎn)中可以單獨(dú)感染，也可以二重或三重混合感染，引起雞群嚴(yán)重的免疫抑制，繼之誘發(fā)細(xì)菌性及其他病毒性感染[5]，給雞群造成更大的損失。近幾年，地方蛋雞和肉雞均有MDV 和ALV的混合感染報(bào)道，但在海蘭蛋雞中MDV 和ALV 的混合感染卻少見(jiàn)報(bào)道。

2017年5月，南陽(yáng)某養(yǎng)殖場(chǎng)雞群從80日齡出現(xiàn)發(fā)病癥狀，并出現(xiàn)死亡，至113日齡時(shí)雞群仍不斷死亡。養(yǎng)殖場(chǎng)主隨即來(lái)農(nóng)大禽病所就診，經(jīng)臨床癥狀、剖檢變化、分子生物學(xué)診斷等方法將該病例確診為禽白血病與馬立克氏病混合感染。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）病例。河南南陽(yáng)某雞場(chǎng)海蘭蛋雞10 000 羽，發(fā)病雞群為113日齡，雞群從80日齡發(fā)病并出現(xiàn)零星死亡，零星死亡一直持續(xù)到100日齡（每天死亡1～2 只），100～113日齡每天死亡5～8 只。但雞群大體精神尚可，典型的變化是不斷有弱雞出現(xiàn)，這些雞精神沉郁、采食量低，極度消瘦或趨于消瘦；雞冠蒼白、皺縮，有的病雞可觸摸到腫大的肝。

2）主要試劑。DNA Marker DL 2000、Taq DNA聚合酶、RRI、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；RNA 提取用Trizol LS Reagent購(gòu)自Invitrogen 公司；瓊脂糖購(gòu)自BIOWEST AGAROSE 公司。

3）主要儀器。生物安全柜、酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；PCR 儀購(gòu)自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；ECP3000 三恒多用電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠；紫外凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Alpha Innotech 公司；Univeral 32R 高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Hettich 公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)自國(guó)華電器有限公司。

1.2 方 法

1）臨床癥狀觀察。詢問(wèn)養(yǎng)殖戶以及現(xiàn)場(chǎng)觀察病雞，并記錄發(fā)病癥狀。

2）剖檢病變觀察。按照病理學(xué)常規(guī)方法剖檢病死雞，并記錄其典型的病理變化。

3）病毒分離鑒定。

①M(fèi)DV 的分離及引物設(shè)計(jì)。將來(lái)自河南南陽(yáng)某雞場(chǎng)的腫瘤病送檢病料（脾和腫瘤組織）用研磨器無(wú)菌研磨（8 000 r/min，5 min），按病料1∶5 加入PBS 液，病料反復(fù)凍融3 次備用。然后采用酚—氯仿抽提法提取患病組織DNA，同時(shí)設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物如下，MDV UL19 P5 上游：5′-CCCGATATTATCATTKCHCC-3′和MDV UL19 P6 下游：5′-CTCGCATTATTATCT GAAGT-3′，擴(kuò)增的DNA 片段預(yù)期長(zhǎng)度為521 bp。

②ALV 和REV 的分離及引物設(shè)計(jì)。因其出現(xiàn)貧血及腫瘤現(xiàn)象，利用組織血液RNA 提取試劑盒提取患病組織RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)合成1對(duì)針對(duì)ALV 特異性引物如下，ALVgp85 U2 上游：5′-GCCACC TCCCCT TTTCAA-3′和ALVgp85 L2下游：5′-GAA AAT TSC GGGTGGTAGC-3′，擴(kuò)增的DNA 片段預(yù)期長(zhǎng)度為778 bp。同時(shí)，設(shè)計(jì)1 對(duì)REV 特異性引物如下，REV-1 上游：5′-CAT ACTGGAGCCAATGGTT-3′和REV-2 下游：5′-AATGTTGTACCG AAGTAC T-3′，擴(kuò)增的DNA 片段預(yù)期長(zhǎng)度為291 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

病雞主要癥狀為張嘴呼吸，雞冠發(fā)白，腳爪干瘦無(wú)光澤（圖1），精神沉郁、消瘦（圖2）。同時(shí)，可見(jiàn)部分病雞虹膜受到侵害導(dǎo)致失明，一側(cè)或兩側(cè)虹膜不正常，色彩消退。

2.2 病理變化

剖檢病雞主要見(jiàn)內(nèi)臟腫瘤：肝臟腫大，見(jiàn)有多個(gè)腫瘤結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)呈紐扣狀或其他形狀，大小不一，遍布肝臟（圖3）；脾臟腫大，可見(jiàn)腫瘤增生（圖4），腎臟局部腫大，腫瘤結(jié)節(jié)可見(jiàn)（圖5），個(gè)別肺部也出現(xiàn)腫大。

2.3 病毒分離鑒定結(jié)果

圖1 腳爪干瘦無(wú)光澤

圖2 病雞消瘦

圖3 肝臟腫大有明顯結(jié)節(jié)

圖4 脾臟重度腫大

圖5 腎臟腫大

1）MDV 的PCR 鑒定。以提取的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果顯示在約521 bp 出現(xiàn)清晰的目的條帶（圖6），與預(yù)期的產(chǎn)物片段大小一致，即MDV 陽(yáng)性。

圖6 MDV PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2）ALV 和REV 的PCR 鑒定。以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果顯示在約778 bp處出現(xiàn)清晰的目的條帶（圖7），與預(yù)期的產(chǎn)物片段大小一致，即ALV 陽(yáng)性，但在291 bp 處未呈現(xiàn)相應(yīng)條帶（圖8），即REV 陰性。

圖7 ALV PCR 擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)該雞場(chǎng)雞群的發(fā)病情況、臨床癥狀、病理剖檢變化、PCR 及RT-PCR 結(jié)果顯示MDV 陽(yáng)性、ALV 陽(yáng)性、REV 陰性等綜合分析，可確診該發(fā)病雞群為馬立克氏病病毒和禽白血病病毒混合感染。綜合以上檢查結(jié)果，確診該雞場(chǎng)雞群混合感染了馬立克氏病病毒和白血病病毒。

3 討 論

圖8 REV PCR 擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)該雞場(chǎng)雞群的臨床表現(xiàn)：雞群精神沉郁、消瘦、雞冠發(fā)白、腳爪干瘦，發(fā)病日齡從80日齡至送診時(shí)不斷有病雞出現(xiàn)，而且病理剖檢可見(jiàn)肝臟、腎臟等臟器腫瘤結(jié)節(jié)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的PCR 檢測(cè)結(jié)果證實(shí)該商品海蘭蛋雞群感染了馬立克氏病病毒和禽白血病病毒。

馬立克氏病、禽白血病和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥均為禽病中常見(jiàn)的病毒性腫瘤病[6]，它們均可引起免疫抑制，也可共感染或引起繼發(fā)、混合感染，導(dǎo)致雞群生產(chǎn)性能下降等[7]。這些疾病在我國(guó)沒(méi)有凈化的雞群中更為常見(jiàn)[8]。但近年來(lái)，其中的2 種疾病共感染在海蘭凈化雞群中發(fā)生還是不多見(jiàn)[9]，而對(duì)于該海蘭雞群發(fā)生MD 和AL 共感染的原因值得思考。在本病例中，MD 發(fā)生的可能原因有：環(huán)境存在強(qiáng)毒導(dǎo)致疫苗毒不能保護(hù)雞群，或者漏防，或者母源抗體干擾，此外也不能排除種雞群攜帶白血病病毒，引起子代雞先天性感染干擾MD 疫苗的免疫而引起MD 發(fā)生。而對(duì)白血病，我國(guó)海蘭蛋雞，尤其引進(jìn)的祖代雞都進(jìn)行了白血病凈化。商品代海蘭蛋雞白血病的發(fā)生和流行率很低，發(fā)病病例也很罕見(jiàn)。而本病例的海蘭商品代蛋雞感染白血病的原因值得探究。養(yǎng)雞場(chǎng)主反映，發(fā)病雞為引進(jìn)青年雞，對(duì)雞苗的來(lái)源與免疫情況不了解，賣方僅說(shuō)要求防疫的疫苗均做了防疫，該批青年雞的父母代種禽來(lái)自質(zhì)量可靠的大廠家。但該病傳播方式為垂直傳播和水平傳播，雞群感染并發(fā)生白血病的最可能原因是種雞帶毒、孵化室污染或者后來(lái)使用了劣質(zhì)疫苗（存在白血病病毒污染的疫苗等）[10]，但具體是何種風(fēng)險(xiǎn)因子導(dǎo)致，因涉及多個(gè)廠家，使用的疫苗也不明晰，無(wú)法進(jìn)行流行病學(xué)追蹤。

為進(jìn)行鑒別診斷，筆者進(jìn)行了REV 的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)為陰性，而MDV 和ALV 陽(yáng)性，進(jìn)一步排除了REV，支持了MD 與AL 共感染。這說(shuō)明在實(shí)際家禽生產(chǎn)中還存在很多生物安全隱患，導(dǎo)致這些腫瘤性疾病發(fā)生；也暗示我國(guó)種禽場(chǎng)需要進(jìn)一步加強(qiáng)這些疾病的凈化，同時(shí)也應(yīng)加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)活疫苗廠家的監(jiān)管，以防通過(guò)劣質(zhì)疫苗引入這些疾病給雞群；更需要注意的是商品代養(yǎng)殖戶要提高自身的生物安全措施和管理水平，以便共同防控疫病，為家禽生產(chǎn)提供保障。