高錦鴻，蘆 鑫，賈 聰，王瑞丹， 孫 強(qiáng)，黃紀(jì)念,3

(1.河南省農(nóng)科院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)產(chǎn)品生物活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心， 鄭州 450002； 3.農(nóng)業(yè)部油料加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430062)

目前，國(guó)內(nèi)芝麻加工以芝麻油生產(chǎn)為主，75%的芝麻用于制油[1]。制油過程中會(huì)產(chǎn)生大量芝麻餅粕，據(jù)測(cè)算，我國(guó)每年產(chǎn)生50萬(wàn)t以上芝麻餅粕[2]。受加工水平所限，國(guó)內(nèi)芝麻餅粕主要用作飼料與肥料，芝麻餅粕資源未得到充分合理利用。研究表明，芝麻餅粕除含有豐富的蛋白質(zhì)外，還含有一定的芝麻素酚糖苷。芝麻素酚糖苷是一種水溶性芝麻木酚素，主要以芝麻素酚三糖苷形式存在，其分子式為C38H48O22[3-4]。盡管芝麻素酚三糖苷在體外抗氧化活性較弱[5-6]，但其在體內(nèi)腸道菌群及β-葡萄糖苷酶作用下可以轉(zhuǎn)化為具有較強(qiáng)抗氧化活性的芝麻素酚及其他酚類化合物，從而降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平[7-9]，對(duì)健康發(fā)揮有益作用，具有研究與應(yīng)用價(jià)值。

目前，從芝麻中提取芝麻素酚三糖苷的方法主要包括磁力攪拌法[10]、超聲波輔助法[11]、回流提取法[12]和亞臨界提取法[13]。磁力攪拌法及回流提取法具有操作簡(jiǎn)單，設(shè)備成本低的優(yōu)點(diǎn)，但存在耗時(shí)較長(zhǎng)，提取率低的問題；亞臨界提取法雖耗時(shí)較短，效率高，但其設(shè)備能耗較高，且不易操作；與前3種方法相比，超聲波輔助法對(duì)于物質(zhì)提取具有強(qiáng)化作用，且操作簡(jiǎn)便，效率高。高錦鴻等[11]以芝麻為原料，乙醇為提取溶劑，研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲提取溫度和超聲提取時(shí)間對(duì)芝麻中芝麻素酚三糖苷提取率的影響規(guī)律，但未對(duì)超聲波輔助提取芝麻素酚三糖苷的其他重要影響因素如超聲功率、超聲波作用方式、pH、轉(zhuǎn)速進(jìn)行分析。因此，本研究在前期試驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上，以芝麻粕為原料，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化提取芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的工藝參數(shù)，并考察超聲功率、超聲波作用方式、pH、轉(zhuǎn)速對(duì)芝麻粕中芝麻素酚三糖苷得率的影響規(guī)律，以期為芝麻粕的高值化利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

亞臨界芝麻粕：芝麻經(jīng)軋坯后，以液化氣為萃取劑，在亞臨界狀態(tài)下，萃取3次，萃取條件為壓力1.0 MPa、萃取溫度50℃、料液比1∶3、萃取時(shí)間2 h，固液分離后得到亞臨界芝麻粕(主要成分：水分(6.86±0.10)%，糖類含量(39.38±0.20)%，蛋白質(zhì)含量(38.21±0.08)%，灰分含量(10.93±0.16)%，脂肪含量(4.62±0.23)%)。

芝麻素酚三糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(實(shí)驗(yàn)室自制[11]，液相純度98.13%)，聚酰胺填料(100～200目)，葡聚糖凝膠LH-20，乙醇、硼酸、凱氏定氮催化劑、濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純，甲醇為色譜純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

XH-2008DE智能溫控雙頻超聲波合成/萃取儀，DL-5-B離心機(jī)，TGL-16A離心機(jī)，XS205電子天平，RE52-86A型旋轉(zhuǎn)蒸儀，Ultimate 3000高效液相色譜儀，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，K-05型全自動(dòng)凱氏定氮儀，KDN-12C數(shù)顯溫控消化爐，TM-0910P陶瓷纖維馬弗爐，CMR-420純水機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取

稱取一定量過60目篩的亞臨界芝麻粕樣品，置于25 mL具塞錐形瓶中，按照料(芝麻粕質(zhì)量)液(乙醇溶液體積)比1∶40，加入80%乙醇溶液，放入轉(zhuǎn)子，調(diào)節(jié)溶液pH，稱重，在不同的超聲波作用方式、功率及轉(zhuǎn)速下，(40±1)℃恒溫提取20 min，提取結(jié)束后，冷卻，補(bǔ)足到先前稱重時(shí)的質(zhì)量，搖勻后靜置，吸取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后置于進(jìn)樣瓶中，高效液相色譜法定量。

1.2.2 芝麻素酚三糖苷的HPLC測(cè)定條件

Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm); 檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm；柱溫 30℃；進(jìn)樣量10 μL。以流動(dòng)相甲醇(A)和水(B)進(jìn)行梯度洗脫：0 min(1 mL/min，40%A)→10 min(1 mL/min,40%A)→15 min(0.8 mL/min,40%A)→35 min(0.8 mL/min,40%A)→40 min(1 mL/min,80%A)→50 min(1 mL/min,80%A)→55 min(1 mL/min,40%A)[11]。

1.2.3 芝麻素酚三糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取9.20 mg(精確至0.01 mg)芝麻素酚三糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，使用甲醇溶解并定容至50 mL,配成質(zhì)量濃度為184 μg/mL的芝麻素酚三糖苷母液，稀釋成質(zhì)量濃度分別為7.36、 18.40、55.20、92.00、128.80、165.60 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC分析，以芝麻素酚三糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(X) 作為橫坐標(biāo)、峰面積(Y) 作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=16.825X-0.493 2，線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 3，線性范圍為7.36～165.60 μg /mL。

1.2.4 芝麻素酚三糖苷得率的計(jì)算

芝麻素酚三糖苷得率=VC/W

式中:V為提取液體積，mL;C為提取液中芝麻素酚三糖苷的質(zhì)量濃度，mg/mL;W為亞臨界芝麻粕質(zhì)量，g 。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析， 采用Origin 8.5進(jìn)行單因素制圖，采用SAS 9.4進(jìn)行響應(yīng)面分析。單因素試驗(yàn)圖中相同字母表示各數(shù)值之間沒有顯著性差異。p<0.05 為顯著，p<0.01 為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲波作用方式的影響

在超聲功率1 200 W、提取液 pH 7.0、轉(zhuǎn)速100 r/min、不同超聲波作用方式(連續(xù)或間歇)條件下超聲提取，研究不同超聲波作用方式對(duì)芝麻素酚三糖苷得率的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知：逐漸延長(zhǎng)超聲波工作時(shí)間，芝麻素酚三糖苷得率逐漸升高，當(dāng)超聲波作用方式為連續(xù)時(shí)，芝麻素酚三糖苷得率最高；隨著超聲波間歇時(shí)間的延長(zhǎng)，芝麻素酚三糖苷得率逐漸降低。因此，選擇超聲波作用方式為連續(xù)。

注：作用方式中的數(shù)據(jù)比為工作時(shí)間與間歇時(shí)間的比，時(shí)間單位為s。

圖1 超聲波作用方式對(duì)芝麻素酚三糖苷得率的影響

2.1.2 超聲功率的影響

在提取液pH 7.0、轉(zhuǎn)速100 r/min、不同超聲功率條件下連續(xù)超聲提取，研究不同超聲功率對(duì)芝麻素酚三糖苷得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖1 超聲功率對(duì)芝麻素酚三糖苷得率的影響

由圖2可知，超聲功率為0 W時(shí)，芝麻素酚三糖苷得率較低，為2.72 mg/g。在0～1 200 W范圍內(nèi)，隨著超聲功率增大，芝麻素酚三糖苷得率隨之提高，這是由于超聲功率增大，空化作用和機(jī)械作用越強(qiáng)烈，芝麻素酚三糖苷擴(kuò)散速率增加，從而提升提取液中濃度[14]。超聲功率為1 200 W時(shí)，芝麻素酚三糖苷得率為4.04 mg/g，與超聲功率為0 W相比，芝麻素酚三糖苷得率提高了48.5%。超聲功率超過1 200 W后，隨著超聲功率的增加，芝麻素酚三糖苷得率趨于平穩(wěn)。故選擇超聲功率為 1 200 W。

2.1.3 提取液pH的影響

在超聲功率1 200 W、轉(zhuǎn)速100 r/min、不同提取液pH條件下連續(xù)超聲提取，研究不同提取液pH對(duì)芝麻素酚三糖苷得率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在酸性條件下，隨著pH的升高，芝麻素酚三糖苷得率整體上逐漸升高，當(dāng)pH達(dá)到7.0時(shí)，芝麻素酚三糖苷得率最高，當(dāng)pH進(jìn)一步升高，溶液呈堿性時(shí)，芝麻素酚三糖苷得率略有下降。這可能是因?yàn)樗嵝詶l件導(dǎo)致芝麻素酚三糖苷結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，使其結(jié)構(gòu)降解或轉(zhuǎn)化為其他化合物，而堿性條件下對(duì)芝麻素酚三糖苷沒有明顯的破壞作用，這一結(jié)果與文獻(xiàn)[15]報(bào)道結(jié)果一致，進(jìn)一步說明芝麻素酚三塘苷在pH 7.0時(shí)結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。因此，選擇提取液pH為7.0。

圖3 提取液pH對(duì)芝麻素酚三糖苷得率的影響

2.1.4 轉(zhuǎn)速的影響

在超聲功率1 200 W、提取液pH 7.0、不同轉(zhuǎn)速條件下連續(xù)超聲提取，研究不同轉(zhuǎn)速對(duì)芝麻素酚三糖苷得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)芝麻素酚三糖苷得率的影響

由圖4可知，隨著轉(zhuǎn)速的提高，芝麻素酚三糖苷得率逐漸升高，在轉(zhuǎn)速達(dá)到400 r/min時(shí)，芝麻素酚三糖苷得率最高，隨著轉(zhuǎn)速的進(jìn)一步提升，芝麻素酚三糖苷得率趨于穩(wěn)定，這說明當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到400 r/min時(shí)，芝麻素酚三糖苷從芝麻粕中溶入溶劑的過程已達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速只會(huì)增加能源消耗。因此，選擇轉(zhuǎn)速為400 r/min。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用連續(xù)超聲提取，以超聲功率(X1)、提取液pH(X2)、轉(zhuǎn)速(X3)為考察因素，以芝麻素酚三糖苷得率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型與方差分析

注：*差異顯著(p<0.05)；**差異極顯著(p<0.01)。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用SAS 9.4 軟件對(duì)芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，得到芝麻素酚三糖苷的最優(yōu)提取條件為超聲功率1 226.29 W、提取液pH 7.73、轉(zhuǎn)速432.19 r/min，此條件下芝麻素酚三糖苷得率的預(yù)測(cè)值為4.34 mg/g。由于實(shí)際操作的可行性，選取超聲功率1 220 W、提取液pH 7.7、轉(zhuǎn)速430 r/min、超聲波作用方式為連續(xù)，進(jìn)行芝麻素酚三糖苷提取試驗(yàn)，重復(fù)3次，平均得率為(4.31±0.03)mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，表明此模型合理有效。說明回歸方程可以反映各因素對(duì)芝麻素酚三糖苷得率的影響。

彭珍等[16]通過回流法對(duì)芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取工藝進(jìn)行研究，最終芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的得率為0.44 mg/g。本研究利用響應(yīng)面優(yōu)化芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取工藝，得率為(4.31±0.03)mg/g，盡管所采用乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比較高，但溶劑可再回收利用，且具有提取時(shí)間短、得率高的優(yōu)勢(shì)。因此，超聲波輔助提取芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的效果較好。

3 結(jié) 論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用SAS 9.4軟件，根據(jù)Box-Behnken 的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用響應(yīng)面優(yōu)化超聲波-磁力攪拌協(xié)同提取芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的工藝條件。通過回歸數(shù)學(xué)模型得到最優(yōu)工藝條件為: 超聲功率1 220 W，提取液pH 7.7，磁力攪拌轉(zhuǎn)速430 r/min，超聲波作用方式為連續(xù)。在最優(yōu)工藝條件下，芝麻素酚三糖苷得率為(4.31±0.03) mg/g。