張 汆,孫艷輝,陳志宏,苗文娟,張榆敏

(1.滁州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州 239000； 2.安徽順鑫盛源生物食品有限公司，安徽 滁州 239000)

大米蛋白具有低過敏、易消化的特點，是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)膳食蛋白，在嬰幼兒食品和高端食品中應(yīng)用前景廣闊。大米胚乳蛋白由清蛋白(2%～5%)、球蛋白(2%～10%)、醇溶蛋白(1%～5%)和谷蛋白(80%左右)組成[1-2]。在利用碎米加工淀粉糖漿時，大米蛋白中的水不溶性醇溶蛋白和谷蛋白會殘留在米渣中。米渣中富含蛋白質(zhì)(40%～70%)、脂類(3%～8%)和灰分(2%～3%)，是工業(yè)用大米膳食蛋白的主要來源[3-4]。

研究表明，大米蛋白具有豐富的營養(yǎng)價值和顯著的調(diào)節(jié)血脂和膽固醇代謝的功效[5]。但是米渣中蛋白質(zhì)的疏水性很強，加之在高溫處理、干燥過程中往往聚集成團，或與纖維素分子聚集在一起，使其水解非常困難。米渣蛋白的水不溶性使其在飲料、營養(yǎng)蛋白粉中的應(yīng)用受到限制。為了提高大米蛋白溶解性，目前常用的方法有酸解法、酶法、化學(xué)改性法等[6-8]。Wang等[9]采用超聲波輔助酶解，結(jié)合超濾的方法制備大米低聚肽，不僅將產(chǎn)物中低聚肽的含量從40%提高到60%，還可以顯著降低酶的成本。

然而，大米肽的加工和大米蛋白的增溶改性有著顯著區(qū)別，前者以獲取小分子肽為主要目的，后者是利用酶的有限水解，在提高蛋白質(zhì)溶解度的同時，盡量避免蛋白質(zhì)分子的大量水解，以保持蛋白質(zhì)作為生物大分子的某些功能性質(zhì)，如起泡性和乳化性[10-11]。王章存等[6]采用Alcalase水解所得大米蛋白水解物的溶解度、發(fā)泡性和乳化性分別為50.2%、50 mL和73.6 mL/g，但文中未指出蛋白水解度。崔沙沙等[7]采用堿性蛋白酶處理，水解度可達(dá)5%，此時大米蛋白水解物溶解度為65.93%。目前，大米蛋白酶法增溶多采用單酶，復(fù)合酶解較少。不同種類蛋白酶具有不同的水解位置，其產(chǎn)物也不同。因此，多酶復(fù)合酶解的效果一般要比單酶好[12]。但是多酶酶解對產(chǎn)物風(fēng)味、功能性質(zhì)的影響往往比較復(fù)雜[13]。

本文在對中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶5種酶制劑單因素實驗分析的基礎(chǔ)上，選擇酶解效果較好的3種酶對大米蛋白進(jìn)行復(fù)合酶法增溶改性。在酶解過程中，考慮到工業(yè)化生產(chǎn)速溶大米蛋白粉(Instant rice protein，IRP)時，調(diào)節(jié)pH會增加酸堿用量，不利于環(huán)保，且影響產(chǎn)品質(zhì)量，故文中蛋白質(zhì)酶解均不調(diào)整pH，保持在中性范圍(5～7)，旨在提高大米蛋白溶解度的同時，又不使蛋白質(zhì)分子過度水解，仍能保持較好的功能性質(zhì)，以拓寬大米蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

食品級超細(xì)大米蛋白粉(300目)，安徽順鑫盛源生物食品有限公司提供，由加工大米淀粉糖漿的副產(chǎn)物、經(jīng)干燥、去雜、粉碎后所得，為淡黃色粉末狀，有大米清香。中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶5種酶，酶活力均為20萬U/g，購自南寧龐博生物工程有限公司。

磷酸鹽、水合茚三酮、NaN3、氯化亞錫等，均為分析純，購自國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

DHS16-A水分測定儀，1601160S杜馬斯燃燒儀，MKX-M1-T馬弗爐，GL-21M高速冷凍離心機，DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，T6可見分光光度計，LG-10B真空冷凍干燥機，A300全自動氨基酸分析儀(德國-曼默博爾)，YRE-301型減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶法制備速溶大米蛋白粉(IRP)

參考文獻(xiàn)[10,12]中的方法制備速溶大米蛋白粉。將一定量的大米蛋白粉(RP)放入容器，加入水，攪拌均勻，加入酶，在設(shè)定溫度下酶解一定時間。酶解結(jié)束后，在95℃下滅酶15 min，離心(4 000 r/min，5 min)，取上清液，定容，分析測定其水解度(DH)和蛋白質(zhì)溶解度。

根據(jù)DH和溶解度結(jié)果，確定酶解條件后，將大米蛋白粉在確定的條件下酶解，所得酶解液冷凍干燥，粉碎后，即為速溶大米蛋白粉，裝袋，備用。

1.2.2 指標(biāo)分析

1.2.2.1 常規(guī)組分測定

水分，采用GB 5009.3—2016直接干燥法測定；粗脂肪，采用GB 5009.6—2016索氏抽提法測定；蛋白質(zhì)，采用GB 5009.5—2016杜馬斯燃燒法測定；灰分，采用GB 5009.4—2016馬弗爐直接灰化法測定。

1.2.2.2 水解度(DH)測定

采用茚三酮比色法測定[14-15]。

1.2.2.3 酶解過程中IRP溶解度測定

取1.2.1離心獲得的上清液，用去離子水定容至100 mL，混勻，吸取5.0 mL，放入干凈鋁盒內(nèi)，在105℃下干燥至恒重。取出，在干燥器內(nèi)冷卻，稱重。按照下式計算IRP溶解度。

式中：m1為5.0 mL酶解液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；m2為樣品大米蛋白粉質(zhì)量，g；100/5為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 不同pH下樣品溶解度曲線繪制

參考文獻(xiàn)[16]中的方法稍作調(diào)整。在25℃、pH 1～12范圍內(nèi)，測定不同pH下RP 和IRP的溶解度，繪制pH-溶解度曲線。

1.2.4 速溶大米蛋白粉中肽含量測定

參照文獻(xiàn)[9]中的方法，做適當(dāng)調(diào)整。稱取一定量的IRP，溶于水中，然后滴加20%三氯乙酸溶液，靜置以沉淀其中的蛋白質(zhì)，離心(4 000 r/min，5 min)，分別收集上清液和沉淀。采用茚三酮比色法測定上清液中的游離氨基酸含量(M1)，采用凱氏定氮法測定沉淀中的蛋白質(zhì)含量(M2)以及IRP中總蛋白質(zhì)含量(M)，則：

IRP中肽含量=M-M1-M2

1.2.5 乳化性測定

參考文獻(xiàn)[17]中的方法制備乳狀液。將蛋白樣品溶于 0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)中，配成蛋白質(zhì)量濃度為 5 mg/mL 的溶液，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.02%的 NaN3抑制微生物生長，室溫下磁力攪拌2 h，4℃過夜使蛋白充分水合。取 15 mL 蛋白溶液與5 mL玉米胚芽油混合，采用高速均質(zhì)機在 12 000 r/min下高速均質(zhì)乳化 1 min 即得乳狀液。根據(jù)文獻(xiàn)[16-17]中的方法測定蛋白樣品的乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)。

1.2.6 氨基酸組成分析

采用全自動氨基酸分析儀進(jìn)行分析，具體操作按照GB 5009.124—2016的方法進(jìn)行。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel分析整理，繪制圖表；采用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)差異顯著性進(jìn)行分析。所有實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3次，結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶對RP酶解單因素實驗

中性蛋白酶屬于內(nèi)切酶，對于肽鍵的選擇性不強，可用于各類蛋白質(zhì)的酶解[18]。圖1是中性蛋白酶酶解條件對RP增溶改性的影響。

注：A實驗條件為酶用量0.8%、酶解溫度50℃、酶解時間2 h；B實驗條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、酶解溫度50℃、酶解時間2 h；C實驗條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、酶用量1.0%、酶解時間2 h；D實驗條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、酶用量1.0%、酶解溫度55℃。

圖1 中性蛋白酶酶解條件對RP增溶改性的影響

由圖1A可知，中性條件下，在10%～20%范圍內(nèi)，隨RP質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，DH和IRP溶解度呈現(xiàn)明顯降低趨勢。綜合考慮RP的增溶效果及生產(chǎn)效率，取RP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，此時DH為5.67%，溶解度為68.26%。由圖1B可知，在RP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%條件下，酶用量在0.2%～1.2%范圍內(nèi)，IRP溶解度和DH均顯著增加，當(dāng)酶用量大于1%時，溶解度和DH增幅變小，故以1%的酶用量為宜，此時IRP溶解度為70.14%，DH為6.34%。由圖1C可知，在40～60℃范圍內(nèi)，酶解溫度的影響呈現(xiàn)典型的峰形，在55℃時IRP具有最高溶解度(69.55%)和DH(6.73%)，但與50℃時IRP溶解度(68.04%)和DH(6.54%)相比增幅不大，故選擇酶解溫度為50℃。由圖1D可知，在1～6 h范圍內(nèi)，隨酶解時間延長，IRP溶解度和DH均呈明顯增加趨勢，綜合增溶效果和時間成本，取酶解時間4 h為宜。因此，中性蛋白酶對RP增溶改性的適宜條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，酶用量1%，酶解溫度50℃，酶解時間4 h。在此條件下，所得IRP溶解度為79.01%，DH為6.79%。

堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶4種酶對RP酶解的單因素實驗結(jié)果表明，各因素變化趨勢與中性蛋白酶相近，但酶解效果差異很大，具體見表1。

表1 蛋白酶酶解RP的單因素實驗結(jié)果

堿性蛋白酶又稱絲氨酸蛋白酶，在pH 6～10范圍內(nèi)穩(wěn)定，pH低于6或大于11時很快失活，其活性中心含絲氨酸[19]。由表1可知，中性條件下，堿性蛋白酶與中性蛋白酶在完全相同的酶解條件下，可達(dá)到較理想的增溶效果，所得IRP溶解度為60.48%，DH為5.47%。

酸性蛋白酶是由黑曲霉優(yōu)良菌種經(jīng)發(fā)酵精制提煉而成，其最適pH為2～4，酶活性部位含有1個或更多的羧基[20]。由表1可知，本實驗中pH均未調(diào)整，不在酸性蛋白酶最適pH范圍內(nèi)，增溶效果不好。在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、酶用量1%、酶解溫度50℃下，即使酶解6 h，IRP溶解度僅為18.24%，DH為1.30%。

菠蘿蛋白酶為巰基蛋白酶，其酶活性受重金屬抑制，優(yōu)先水解堿性氨基酸(如精氨酸)或芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸)羧基側(cè)上的肽鏈[21]。由表1可知，菠蘿蛋白酶對RP酶解的適宜條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，酶用量1%，酶解溫度55℃，酶解時間4 h。在適宜條件下，IRP溶解度為27.40%，DH為1.71%，效果僅稍好于酸性蛋白酶。

木瓜蛋白酶是一種低特異性蛋白水解酶，其活性中心含半胱氨酸，屬于巰基蛋白酶，可水解蛋白質(zhì)和多肽中精氨酸和賴氨酸的羧基端，并能優(yōu)先水解肽鍵的N—端具有2個羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽鍵[22]。由表1可知，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、酶用量1%、酶解溫度55℃、酶解時間4 h的條件下，增溶效果較好，所得IRP溶解度和DH分別為45.55%、4.04%。

綜上所述，基于中性pH下RP的增溶改性，單酶酶解效果較好的是中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶，其適宜酶解條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、酶解溫度50～55℃、酶用量1%、酶解時間4 h。所得IRP溶解度分別為79.01%、60.48%和45.55%，基本達(dá)到了RP增溶改性目標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，分析探討這3種酶對RP的復(fù)合增溶效果。

2.2 RP的復(fù)合酶法增溶改性

中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對RP的復(fù)合酶法增溶結(jié)果見表2。

表2 RP的復(fù)合酶法增溶改性產(chǎn)物及其乳化特性

注：①中性蛋白酶，②堿性蛋白酶，③木瓜蛋白酶；復(fù)合酶解中，總酶用量1.0%，各單酶用量比例相等，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，酶解溫度50℃，酶解時間4 h。

由表2可知，在復(fù)合酶解中，以①②(中性蛋白酶+堿性蛋白酶)和①③(中性蛋白酶+木瓜蛋白酶)的增溶改性效果較好，IRP不僅具有較高的溶解度(65.73%和63.58%)，而且具有良好的乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)，其中①③(中性蛋白酶+木瓜蛋白酶)復(fù)合酶解所得IRP的EAI(27.60 m2/g)和ESI(29.61 min)均較高。因此，RP復(fù)合酶增溶改性的適宜條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶用量各為0.5%，酶解溫度50℃，酶解時間4 h。在適宜條件下，所得IRP具有良好的溶解性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

2.3 理化性質(zhì)

2.3.1 主要組分

表3是RP和復(fù)合酶適宜條件下改性所得IRP的主要組分。

表3 RP 和IRP的主要組分 %

注：表中非水組分含量均為干基含量。

由表3可知：IRP中蛋白質(zhì)含量略高于RP，灰分和粗脂肪含量略低于RP，但差異不大；酶解后，IRP中游離氨基酸和肽含量顯著增加，分別為5.68%和16.19%。說明RP經(jīng)復(fù)合酶解改性后，不僅溶解度得到顯著提升，且營養(yǎng)價值也得到明顯改善，更易于消化吸收。

2.3.2 氨基酸組成(見表4)

注：*為必需氨基酸；呈味氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸。

由表4可知，IRP中必需氨基總量和呈味氨基酸總量都略高于RP。說明復(fù)合酶改性不僅可以提高RP的溶解度和乳化性，還可以改善其風(fēng)味。RP的增溶改性要適當(dāng)控制DH，以免生成太多苦味肽，影響IRP的口感[10]。

2.3.3 不同pH下的溶解度

在pH 1～12范圍內(nèi)，RP改性前后的溶解度隨pH的變化趨勢如圖2所示。

圖2 RP 和IRP的溶解度曲線

由圖2可知，RP在pH高于7時，溶解度才有明顯增加，pH 8時，溶解度僅為18.91%。但在一般食品中pH高于8的情況很少。經(jīng)復(fù)合酶改性后，IRP溶解性有明顯改善，在酸性(pH 4)條件下，溶解度也有38.27%，在pH 5～8范圍內(nèi)，溶解度可達(dá)54.39%～68.34%。說明經(jīng)復(fù)合酶改性后，IRP在較寬的pH條件下，仍可保持較高的溶解度。

3 結(jié) 論

通過對5種常見蛋白酶中性pH條件下酶解RP的單因素實驗分析，以中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶3種單酶對RP的增溶改性效果較好，將其用于RP的復(fù)合酶解。綜合考慮蛋白質(zhì)溶解度、DH和功能性質(zhì)等要求，RP的適宜酶法增溶條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)合酶解，酶用量各0.5%，酶解溫度50℃，酶解時間4 h。適宜條件下復(fù)合酶所得IRP具有較高的溶解度(63.58%)、乳化活性(27.60 m2/g)和乳化穩(wěn)定性(29.61 min)，在pH 5～8范圍內(nèi)也顯示出較好的溶解性(溶解度54.39%～68.34%)。此外，經(jīng)復(fù)合酶法改性后，IRP中的游離氨基酸和肽含量顯著增加，分別為5.68%和16.19%。說明RP經(jīng)復(fù)合酶酶解改性后，不僅溶解度得到顯著提升，且營養(yǎng)價值也得到明顯改善，更易于消化吸收。