宋揚(yáng) 楊西斌 閆冰 王馳 孫建美 熊大曦

1) (上海大學(xué)機(jī)電工程與自動化學(xué)院,上海 200444)

2) (中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所,光與健康研究中心,蘇州 215163)

利用直徑微米量級的透明微球與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相結(jié)合,可以在白光下實(shí)現(xiàn)超分辨成像.目前大部分研究是將微球直接播撒到樣品表面,由于微球位置的隨機(jī)性和不連續(xù)性導(dǎo)致無法實(shí)現(xiàn)特定區(qū)域的完整成像,極大限制了該技術(shù)的使用范圍.使用微探針或微懸臂黏附微球,通過三維位移臺精確控制微球位置,一定程度上解決了上述問題,但是需要對微球位置進(jìn)行精準(zhǔn)操控.本文提出了一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、參數(shù)可控、簡單易用的基于一體化微球物鏡的超分辨成像系統(tǒng),對微球與物鏡進(jìn)行了一體化安裝設(shè)計,通過設(shè)計側(cè)視成像及位置反饋系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對微球、物鏡和樣品三者之間距離的精準(zhǔn)控制,結(jié)合通用的顯微成像系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了對可控特定區(qū)域的超分辨成像.該系統(tǒng)將普通顯微物鏡(40×,NA 0.6)的分辨能力提高了4.78倍,最高可以看到100 nm的樣品特征.該一體化物鏡可以搭配普通光學(xué)顯微系統(tǒng)使用,實(shí)現(xiàn)超分辨成像,提高了微球超分辨技術(shù)的通用性,在亞衍射極限樣品的超分辨成像方面具有廣泛的應(yīng)用價值.

1 引 言

傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡受到衍射極限的限制,最高橫向分辨率約為200 nm,難以觀測亞衍射極限樣品的特征.近年來,多種超分辨熒光顯微成像技術(shù)逐步出現(xiàn),根據(jù)不同的成像原理,超分辨顯微成像技術(shù)可分為兩大類: 1)利用單分子定位方法突破衍射極限,包括隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù)(STORM)[1]、光激活定位顯微術(shù)(PALM)[2]和fPALM技術(shù)[3]等;2)改變光源照明方式,調(diào)制點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)來實(shí)現(xiàn)分辨率的提高,例如受激發(fā)射損耗顯微術(shù)(STED)[4]、結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù) (SIM)[5]和飽和SIM技術(shù)[6]等.然而,上述超分辨熒光技術(shù)受限于熒光分子自身特性,無法在白光照明下實(shí)現(xiàn)超分辨成像.

Wang等[7?9]提出了微球超分辨成像技術(shù),借助直徑微米級的透明電介質(zhì)微球,利用微球?qū)θ肷涔獾膩啿ㄩL聚焦特性,傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡可以在白光下實(shí)現(xiàn) 50 nm 分辨率的成像,如圖1(a)所示,為實(shí)現(xiàn)超分辨成像提供了一種全新的方法.2013年,Li等[10]將微球浸沒水中,實(shí)現(xiàn)了對75 nm腺病毒的白光成像;Hao 等[11,12]和 Darafsheh 等[13?15]直接將微球半浸沒或全浸沒在酒精或異丙醇等介質(zhì)中,但是這些方式只能對樣品進(jìn)行一次性觀察,同時浸沒介質(zhì)的易揮發(fā)性嚴(yán)重影響觀察的穩(wěn)定性;隨后,Darafsheh 等[16,17]改進(jìn)微球使用方法,利用硅膠將鈦酸鋇微球封裝成硅膠薄膜,但硅膠薄膜與樣品的粘黏作用不可避免會損壞樣品表面.在這些使用方式中,微球相對樣品固定,并隨機(jī)分布在被觀測樣品表面,這些使用方式導(dǎo)致了微球位置的隨機(jī)性和不連續(xù)性,無法實(shí)現(xiàn)特定區(qū)域的完整成像,而且待測樣品被微球及浸沒介質(zhì)污染,極大限制了該技術(shù)的使用范圍.

近年來,國內(nèi)外學(xué)者為了擴(kuò)展微球超分辨成像技術(shù)的應(yīng)用范圍,進(jìn)行了大量改進(jìn)研究.為了實(shí)現(xiàn)對微球位置的控制,2013 年,Krivitsky 等[18]通過氣壓吸附或膠水固化等方式將微球固定在玻璃微管尖端上,實(shí)現(xiàn)了對間距73 nm的分割正方形的超分辨結(jié)構(gòu)觀察;文獻(xiàn)[19?21]中,研究者先后使用毛細(xì)管微懸臂和AFM微懸臂黏附直徑7.5 μm的微球,實(shí)現(xiàn)了對DVD光盤的高分辨結(jié)構(gòu)和刻蝕光柵的超分辨結(jié)構(gòu)的觀察;2016 年,Wang 等[22]借助原有AFM系統(tǒng),將微球黏附在AFM探針尖端上,利用AFM的等高掃描模式和接觸掃描模式,在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大范圍超分辨成像,同時避免了探針對樣品的破壞,如圖1(b) 所示;2018 年,陳濤等[23]將鈦酸鋇玻璃微球黏附在鎢探針上,使用多軸微動平臺對微球進(jìn)行精確操作實(shí)現(xiàn)了130 nm的超分辨成像.這些裝置都可以對特定區(qū)域進(jìn)行超分辨成像,但是微懸臂或者微探針的脆弱性會導(dǎo)致其發(fā)生損壞.2017 年,Yan 等[24]通過自制透鏡適配器將傳統(tǒng)的顯微鏡物鏡與微球集成一體,實(shí)現(xiàn)了超分辨成像,但是該適配器由3D打印而成,精度不高,微調(diào)難度較大,同時無法對成像參數(shù)進(jìn)行評價.2018年,新加坡國立大學(xué)Chen等[25]使用適配器將物鏡與微球結(jié)合為一體,開發(fā)了一款微球納米成像平臺,如圖1(c)所示,該設(shè)計可以搭配不同類型的物鏡和不同種類的微球,利用步進(jìn)電機(jī)調(diào)節(jié)微球與物鏡之間的距離.作者使用浸油物鏡(100×,NA1.4)和直徑20 μm的二氧化硅微球在白光下觀測到了23 nm的納米點(diǎn)對特征.在此基礎(chǔ)上,2020年,Phaos等[26]推出了OptoNano系列微球輔助顯微鏡,如圖1(d)所示,在現(xiàn)有的 OptoNano 200 產(chǎn)品中,將微球與物鏡 (50×,NA 0.55)結(jié)合為一體,經(jīng)分辨率板標(biāo)定,可以實(shí)現(xiàn)137 nm的分辨率.

圖1 (a)直接播撒微球成像示意圖;(b)AFM 探針操控微球成像示意圖;(c)微球通用鏡頭適配器;(d)微球輔助顯微鏡OptoNano 200Fig.1.(a) Schematic of spread the microspheres;(b) Schematic of AFM probes control microspheres;(c) The universal lens adaptor for the microsphere;(d)Microsphere assisted microscopy OptoNano 200.

目前存在的微球使用方式各有優(yōu)勢,但是還未解決系統(tǒng)的易用性和成像參數(shù)的可控性等難題.本文理論分析了微球聚焦光斑直徑對超分辨能力的影響,將微球與現(xiàn)有物鏡整合一體,集成側(cè)視成像反饋系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了白光下對亞衍射極限樣品的實(shí)時觀測,并對系統(tǒng)的成像參數(shù)進(jìn)行分析.理論和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該系統(tǒng)可以在空氣中實(shí)現(xiàn)超分辨成像,極大提升了物鏡性能,精簡了系統(tǒng)結(jié)構(gòu),提高了微球的適用性,降低了成像系統(tǒng)成本.

2 理論分析及仿真

微球透鏡的超分辨成像能力被廣泛研究,Wang等[7]認(rèn)為通過微球聚焦產(chǎn)生的光子納米射流效應(yīng)使其能夠?qū)崿F(xiàn)超分辨成像,該射流長度可達(dá)幾個甚至十幾個波長,其能量最大處被定義為微球焦點(diǎn),焦點(diǎn)處的半高寬被稱為聚焦光斑直徑,該直徑可以小于半個波長.文獻(xiàn)表明[27?29],成像分辨率會受微球及周圍介質(zhì)的光學(xué)參數(shù)影響,包括微球尺寸、折射率、入射光源、周圍介質(zhì)的折射率和與襯底相互作用等因素.研究發(fā)現(xiàn),更小尺寸的微球(如 <10 μm)可以獲取更高的成像分辨能力,這是由于微球在接觸樣品成像實(shí)驗(yàn)中,其產(chǎn)生的光子納米射流更接近微球與樣品的交界面,此時近場環(huán)境下的倏逝波可以被更有效地捕獲,并通過微球轉(zhuǎn)換成可以被采集的傳播波.然而,由于小尺寸的微球通常成像視場非常小,工作距離很短(基本接觸條件下成像),所以實(shí)用性較低,不利于技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展.因此,基于此考慮,可以選用較大的微球.本文采用較大尺寸的微球,在保證分辨率的基礎(chǔ)上,試圖增加其工作距離,從而做到非侵入式成像,更好地適應(yīng)多樣化的樣品觀測.

綜合以上因素,確定相關(guān)系統(tǒng)參數(shù)對微球成像能力進(jìn)行仿真,本文選用聚二甲基硅氧烷(PDMS)(折射率n1=1.4 )作為封裝介質(zhì),使用鈦酸鋇(BTG)(Cospheric,直徑D1=100 μm,折射率n2=1.9 )微球進(jìn)行成像仿真分析,設(shè)定仿真光源為波長470 nm 的平面波.在對微球的仿真中,光波穿過半封裝于PDMS的鈦酸鋇微球射入空氣中,由于微米量級的微球?qū)獠ǖ闹C振作用,光波的傳輸過程滿足以下方程:

其中E是光矢量,k是波數(shù),μ與ε分別是材料的磁導(dǎo)率和介電常數(shù),ω是光波的角頻率.在該模型中,外邊界均采用散射邊界條件,網(wǎng)格大小小于λ/4 以保證模型求解的精確度.

首先研究半封裝于PDMS中的不同直徑BTG微球形成的光子納米射流(photonic nanojet,PNJ)的狀態(tài).如圖2(a)所示,藍(lán)、綠、紅三條曲線分別代表直徑50,75 和100 μm的BTG微球形成的光子納米射流沿Z軸方向的光強(qiáng)變化曲線.由圖可知,隨著微球直徑的增加,光子納米射流PNJ越長,微球焦距越長,且焦點(diǎn)處能量越大.圖2(b)表示三種直徑微球形成的光子納米射流半高寬(FWHM)在工作距離增加時的變化狀態(tài),其中黑色直線表示衍射極限 (l/2=0.235 μm),可以看到,直徑越大的微球可以在越長的工作距離下突破衍射極限,如100 μm微球?qū)崿F(xiàn)超分辨的工作距離<13 μm,75 μm 微球的工作距離 <10 μm,50 μm微球的工作距離 <7 μm,并且在超出此工作距離后半高寬迅速提升,伴隨著明顯的波動.在三種尺寸微球的仿真結(jié)果對比中,直徑100 μm微球在較長工作距離內(nèi)保持FWHM

同時,對直徑100 μm微球及其周圍的電場強(qiáng)度分布進(jìn)行仿真,結(jié)果如圖2(c)所示,圖中顯示光線經(jīng)過半封裝微球聚焦后形成光子納米射流,該射流位于微球正下方一定距離的空氣中,且中間位置存在明顯斷層.正好與圖2(a)能量曲線中兩個波峰之間的波谷相對應(yīng),兩個波峰的強(qiáng)度分別是入射光的7871倍和7797倍,對應(yīng)的工作距離分別為14.3 和 21 μm.第一個波峰即為微球的焦點(diǎn),在焦點(diǎn)范圍內(nèi),微球聚焦光斑直徑小于λ/2 時,可以實(shí)現(xiàn)超分辨成像.后一個波峰是由半浸沒微球的PDMS對光線的匯聚產(chǎn)生的,由于其聚焦光斑直徑較大,工作距離太長,此時微球已經(jīng)失去了超分辨能力.在圖2(b)中,聚焦光斑在工作距離 2 μm處的直徑最小,值為 150 nm (l/3.13),同時聚焦光斑直徑隨工作距離的增加而不斷增大,在13 μm處超過λ/2 ,隨后聚焦光斑迅速發(fā)散,聚焦效果逐漸消失.總而言之,直徑 100 μm 的半封裝 BTG 微球在小于13 μm的工作距離內(nèi)具有超分辨能力.

圖2 (a) 直徑 50,75 和 100 μm 的 BTG 微球形成的光子納米射流沿Z軸方向的光強(qiáng)變化曲線;(b)三種直徑微球形成的光子納米射流的半高寬變化狀態(tài);(c)在波長470 nm的光源下,直徑 100 μm微球形成的光子納米射流狀態(tài)Fig.2.(a) Intensity curve value in Z-axis direction of the photonic nanojet formed by BTG microspheres with diameters of 50,75 and 100 μm;(b) FWHM of the photonic nanojet formed by BTG microspheres;(c) The photonic nanojet formed by 100 μm microspheres at the wavelength of 470 nm.

3 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

使用仿真中所用的BTG微球和PDMS半封裝介質(zhì)來制作一體化微球物鏡并裝載到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中.

實(shí)驗(yàn)裝置及原理圖如圖3所示,實(shí)驗(yàn)裝置由顯微成像系統(tǒng)和側(cè)視成像反饋系統(tǒng)組成.在顯微成像系統(tǒng)中,使用主波長470 nm的LED光源進(jìn)行照明,照明光路使用孔徑光闌和視場光闌進(jìn)行斜照調(diào)節(jié),以提高微球成像質(zhì)量,使用 CMOS相機(jī)(OPLENIC,ΜSC180,分辨率 4912 × 3684 pixels,像素尺寸 1.25 μm × 1.25 μm)接收顯微圖像信息.側(cè)視成像模塊由CMOS相機(jī)(Mshot,MS23,分辨率1920 × 1200 pixels,像素尺寸5.86 μm × 5.86 μm)搭配光學(xué)變焦鏡頭 (XDS-10 A,光學(xué)放大率2.8—18×,工作距離 32 mm)組成,與一體化物鏡和電動位移臺 (Shinopto,Nanomotor SNM01,步長 <30 nm)相結(jié)合構(gòu)成側(cè)視成像反饋系統(tǒng),該系統(tǒng)可以輔助制作一體式微球物鏡,同時在使用時對微球成像參數(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)節(jié).與OptoNano 200相比,該裝置所具備的側(cè)視成像反饋系統(tǒng)可以在成像過程中實(shí)時觀測微球狀態(tài),以實(shí)現(xiàn)對微球的精準(zhǔn)操控,避免微球或樣品造成損壞.

一體化微球物鏡如圖4(a)所示,該物鏡由普通物鏡 (40×,NA 0.6,WD=4 mm)、旋轉(zhuǎn)套筒和固定套筒組成,使用硅膠將微球封裝在旋轉(zhuǎn)套筒的平凸透鏡 (Thorlabs,LA1700,直徑D2=6 mm,焦距f=30 mm,中心厚度 1.8 mm,曲率 0.61)上,套筒之間使用超細(xì)牙螺紋(螺距P=0.35 mm)連接以實(shí)現(xiàn)軸線方向的精細(xì)可調(diào).制作過程如圖4(b)所示,主要包括制作分離的金屬套筒,PDMS的滴加和旋涂 (2000 rpm,1 min,形成 10 μm 厚涂層),微球的黏附和加熱固化 (90 ℃,30 min).其中,需要將物鏡安裝在顯微系統(tǒng)上,使用側(cè)視成像反饋系統(tǒng)黏附微球.側(cè)視成像反饋系統(tǒng)如圖4(c)所示,微球黏附過程由側(cè)視成像系統(tǒng)拍攝,如圖4(d)所示,首先移動微球至物鏡正下方,此時由于LED光源的照射,微球上呈現(xiàn)亮斑.接著平凸透鏡下壓,直至微球被PDMS吸附,吸附完成后將位移臺下移以避免二次接觸已黏附的微球.這樣就可以將微球與物鏡整合一體化,實(shí)現(xiàn)特定區(qū)域的超分辨成像.

圖3 微球成像系統(tǒng)原理圖及實(shí)驗(yàn)裝置圖Fig.3.Schematic and experimental set-up diagram of microsphere imaging system.

圖4 (a)超分辨微球物鏡實(shí)物圖;(b)超分辨微球物鏡的制作過程,主要包括 1) 套筒的制作,2)PDMS 的涂覆,3)微球的黏附,4)一體化物鏡;(c)側(cè)視成像反饋系統(tǒng)實(shí)物圖;(d)微球的黏附過程,主要包括1)微球的定位,2)透鏡的下壓,3)微球的黏附,4)位移臺的下移Fig.4.(a) Physical image of the super-resolution microsphere objective;(b) Fabrication of the super-resolution microsphere objective lens.It mainly includes 1) sleeves,2) coating of PDMS,3) adhesion of microspheres,4) integrated objective lens;(c) Physical image of side-view imaging and position feedback system;(d) Adhesion of microspheres.It mainly includes 1) positioning of microspheres,2) downward of the lens,3) adhesion of microspheres,4) downward of the displacement table.

圖5 (a)側(cè)視成像反饋系統(tǒng)的標(biāo)定;(b)標(biāo)定后的側(cè)視成像反饋系統(tǒng)可以對微球的工作距離進(jìn)行實(shí)時測量,此時微球工作距離為 12.65 μmFig.5.(a) Calibration of side-view imaging feedback system;(b) An example of microsphere lens working at a distance of 12.65 μm.

圖6 (a)掃描電子顯微鏡 (SEM)觀測到的 CPU 點(diǎn)陣結(jié)構(gòu);(b)不使用微球時的觀察效果;(c)?(h)使用直徑 100 μm 微球分別在工作距離 2.78,4.63,5.55,7.72,9.57 和 12.65 μm 處觀察到的點(diǎn)陣效果,每組圖的左側(cè)為顯微圖像,其中白色圓圈內(nèi)是視場范圍,直徑(白色線段)處的灰度值變化曲線如右下角所示,右上角是相應(yīng)的側(cè)視圖.它們都可以有效分辨出200 nm的點(diǎn)陣特征;(i)微球放大倍數(shù)與工作距離的關(guān)系曲線Fig.6.(a) The CPU lattice structure,400 nm blocks and 200 nm intervals,observed by scanning electron microscope (SEM);(b) the observation without microsphere lens;(c)?(h) the lattice observed at the working distance of 2.78,4.63,5.55,7.72,9.57 and 12.65 μm,respectively,with 100 μm diameter microspheres.The left side of each group of images is the microscopic image,in which the field of view is inside the white circle,the gray value change curve at the diameter (the white line) is shown in the lower right corner,and the upper right corner is the corresponding side-view images.All of them can effectively distinguish 200 nm lattice features;(i) the relationship curve between the magnification factor and the working distance of the microsphere.

其中,在黏附和操控微球之前,需要對側(cè)視成像反饋系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)定,對USAF1951分辨率板進(jìn)行成像,所采用的相機(jī)單像素尺寸為 5.86 μm ×5.86 μm,該系統(tǒng)最高可以分辨的線對為 (group 7,element 6),標(biāo)定結(jié)果如圖5(a)所示,對應(yīng)到相機(jī)靶面上的圖像分辨率約 0.41 μm/pixel.同時,使用側(cè)視成像反饋系統(tǒng)對微球的工作距離進(jìn)行測量,如圖5(b)所示,圖中下部分的微球是由上方的封裝微球通過樣品反射形成的倒影,兩球間距的一半即為工作距離,此時微球的工作距離為 12.65 μm.通過標(biāo)定,可以利用該側(cè)視成像系統(tǒng)對微球與樣品之間的距離進(jìn)行實(shí)時測量,控制微球超分辨系統(tǒng)工作距離,并防止微球碰觸樣品造成的樣品損傷.

4 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析

為了驗(yàn)證一體化微球物鏡的成像效果,探究微球工作距離對放大倍數(shù)和成像對比度的影響,實(shí)驗(yàn)選用CPU芯片上的微小點(diǎn)陣列作為觀測對象.實(shí)驗(yàn)之前需要對CPU芯片進(jìn)行清洗,放入丙酮中超聲波震蕩3 min,然后使用酒精沖洗,最后在加熱臺上烘干.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示,圖6(a)為掃描電子顯微鏡(SEM)觀測到的芯片內(nèi)部的點(diǎn)陣列特征,該點(diǎn)陣列中特征點(diǎn)長寬為 400 nm,間距為 200 nm,圖6(b)是不使用微球,只通過物鏡對芯片進(jìn)行觀察得到的結(jié)果,該圖像無法分辨規(guī)則的點(diǎn)陣列結(jié)構(gòu).圖6(c)—圖6(h)是使用微球在不同的工作距離上觀測到的一系列圖像,在成像過程中,一直用側(cè)視成像系統(tǒng)對微球與樣品之間的距離進(jìn)行監(jiān)測,從而測量不同工作距離下的系統(tǒng)放大倍數(shù)以及視場范圍.如圖6(c)—圖6(h)所示,每幅圖的左側(cè)是微球在不同工作距離下的顯微成像圖,右上角是側(cè)視成像系統(tǒng)監(jiān)測到的相應(yīng)的微球工作距離,顯微成像圖中的白色圓圈內(nèi)即為成像視場,圓圈直徑(白色直線)處的灰度變化情況如右下角的歸一化灰度值曲線所示,在成像視場內(nèi)可以清晰觀測到200 nm的芯片特征,視場之外雖然也有被照亮的區(qū)域,但是由于微球球差等因素的影響已無法清晰成像.圖6(i)是一體化物鏡放大倍率隨工作距離的變化曲線,放大倍數(shù)隨著工作距離的增加而增大.可以發(fā)現(xiàn),工作距離在 2.78—12.65 μm 之間時,通過使用封裝直徑100 μm微球的一體化物鏡,都可以在一定視場范圍內(nèi)清晰分辨出200 nm的芯片特征,與仿真結(jié)果相符.此外,經(jīng)過實(shí)際測量,在工作距 離 2.78,4.63,5.55,7.72,9.57 和 12.65 μm處,通過微球可以分別實(shí)現(xiàn) 2.55×,2.79×,3.29×,4.26×,4.46×和 5.12×的 放 大 倍 數(shù) ,視 場 范 圍(FOV)分別可以達(dá)到 31.27,34.94,36.21,44.18,61.79 和 67.05 μm2.總之,隨著微球工作距離的增加,系統(tǒng)放大倍數(shù)逐漸增大,成像視場不斷增加,但是圖像對比度不斷下降.

為進(jìn)一步量化該成像系統(tǒng)的超分辨成像能力,選用具有周期性條紋 (周期為 300 nm,由 200 nm的線寬和100 nm的溝槽組成)的藍(lán)光光盤作為觀測樣品,觀測之前需要將光盤外層的保護(hù)膜去掉,將條紋結(jié)構(gòu)直接暴露在空氣中.

圖7 (a)掃描電子顯微鏡(SEM)觀測到的藍(lán)光光盤條紋;(b)不使用微球時的觀察效果;(c)使用微球時的觀察效果.左側(cè)為顯微圖像,可以清晰地觀察到藍(lán)光光盤條紋,其中白色圓圈內(nèi)是視場范圍,直徑(白色線段)處的灰度值變化曲線如右下角所示,右上角是相應(yīng)的側(cè)視圖.此時的工作距離約為 3 μm,視場范圍約 8.04 μm2Fig.7.(a) The BD-ROM fringe observed by scanning electron microscope (SEM);(b) the observation without microsphere lens;(c) the observation with microsphere lens.The left side of image is the microscopic image,the BD-ROM fringe can be observed clearly,in which the field of view is inside the white circle,the gray value change curve at the diameter (the white line) is shown in the lower right corner,and the upper right corner is the corresponding side-view images.The working distance is about 3 μm and the field of view is about 8.04 μm2.

觀測結(jié)果如圖7所示,圖7(a)是掃描電子顯微鏡(SEM)觀測的藍(lán)光光盤條紋圖像.圖7(b)是在該成像系統(tǒng)下,不使用微球?qū)λ{(lán)光光盤進(jìn)行觀察的圖像,無法看到光盤上的條紋.圖7(c)是在該成像系統(tǒng)下,使用封裝直徑100 μm微球的一體化物鏡觀測的圖像,左側(cè)是顯微成像圖,可以清晰看到規(guī)則的藍(lán)光條紋,其中白色圓圈內(nèi)是視場范圍,約8.04 μm2,圓圈外雖然也被照亮,但是條紋特征逐漸消失,直徑(白色線段)處的灰度值變化情況如右下角灰度值歸一化曲線所示,可以明顯分辨出與光盤周期性一致的條紋特征.圖片背景從左上至右下發(fā)生灰度值漸變,是由于使用孔徑光闌和視場光闌進(jìn)行了斜照調(diào)節(jié),通過調(diào)節(jié)可以有效提高圖像對比度.右上角為相應(yīng)的側(cè)視成像圖,此時工作距離約為3 μm.在實(shí)驗(yàn)中,隨著工作距離的不斷增大,圖像對比度不斷降低,超分辨效果逐漸消失.

5 結(jié) 論

本文設(shè)計了一種基于一體化微球物鏡的超分辨成像系統(tǒng),將微球與物鏡整合一體,結(jié)合側(cè)視成像反饋系統(tǒng)對微球物鏡的成像參數(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)節(jié),實(shí)現(xiàn)了可控區(qū)域的超分辨成像.通過理論仿真和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,使用波長 470 nm光源進(jìn)行照明,該系統(tǒng)可以在小于12.65 μm的工作距離范圍內(nèi)觀測到200 nm 的樣品特征,隨著工作距離減小,放大倍數(shù)逐漸降低,圖像對比度增加,系統(tǒng)分辨能力增強(qiáng),當(dāng)工作距離小于 3 μm時,該系統(tǒng)可以觀測到100 nm的樣品特征.該設(shè)計結(jié)構(gòu)簡單,操作方便,可以搭配傳統(tǒng)的明場顯微鏡使用,極大提高了物鏡成像性能,具有廣泛的使用價值.