劉金玉 高月皓 黃金碩 張 芹

(河北農(nóng)業(yè)大學園林與旅游學院，保定 071000)

近年來，溫室效應(yīng)不斷加劇，全球氣候變暖，我國各地區(qū)的平均氣溫逐年升高，尤其是夏季持續(xù)高溫已經(jīng)成為許多喜冷涼植物生長發(fā)育的制約因素。金蓮花(TrolliuschinensisBunge.)為毛茛科(Ranunculaceae)金蓮花屬(Trollius)多年生草本植物，其花葉秀美，可用作觀賞植物[1]，花可以入藥，也是我國重要的傳統(tǒng)藥用植物[2～3]。因其市場需求量大，近年來金蓮花野生資源遭到嚴重破壞，處于瀕危狀態(tài)。因此開展金蓮花引種繁殖，擴大栽培范圍，對滿足市場需求及保護野生金蓮花資源具有重要意義。但金蓮花性喜冷涼濕潤、陽光較為充足的環(huán)境，最適生長溫度為18～24℃[1,4]，引種到北方低海拔地區(qū)栽培時幼苗越夏生長不良，因此，研究提高金蓮花耐熱性的措施成為栽培引種中亟待解決的問題。水楊酸(SA)作為一種外源調(diào)節(jié)物質(zhì)，在提高植物抗逆性方面已有許多報道[5～11]。但有關(guān)金蓮花的研究多集中在種子萌發(fā)、栽培管理、藥用成分、醫(yī)藥制劑等方面[12～14]，外源水楊酸對金蓮花耐熱性的影響尚未見報道。本試驗以金蓮花盆栽苗為材料，研究外施不同濃度的水楊酸對高溫脅迫下金蓮花幼苗生長及生理的影響，旨在為提高金蓮花的耐熱性提供理論和技術(shù)指導。另外，電阻抗圖譜法(EIS)是由等效電路代表所測定植物器官樣本，可快速獲得植物基本生理學信息[15]，在評測植物抗逆性方面更加便捷[16～19]。本研究中采用EIS結(jié)合生理指標評測金蓮花的耐熱性，為今后應(yīng)用一種快速鑒定金蓮花耐熱性的方法提供依據(jù)，也為其他植物抗逆性鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2017年3～9月份在河北農(nóng)業(yè)大學實驗基地進行。供試材料為當年生的金蓮花幼苗，栽植于10 cm×10 cm的花盆中，每盆1株，栽培基質(zhì)為草炭∶珍珠巖=3∶1，置于溫室內(nèi)進行統(tǒng)一常規(guī)管理。待植株生長狀況較穩(wěn)定時，選取長勢一致、健壯無病蟲害的金蓮花幼苗進行試驗。外源水楊酸(SA)設(shè)置4個濃度梯度(0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1)，試驗前首先噴灑蒸餾水清潔苗體，濾紙吸干水分，然后分別采用不同濃度的SA于上午8點噴施幼苗葉片正反兩面，以噴施蒸餾水為對照，以葉片上液體欲滴為宜，連續(xù)噴施2 d，保證幼苗充分吸收。然后將處理過的幼苗置于PGX-3500-DN型人工氣候箱進行6～72 h高溫脅迫，溫度設(shè)為晝38℃/夜30℃，濕度為50%～70%，光照強度為6 000 lx，之后常溫25℃恢復生長4 d。每處理3次重復，每個重復10株幼苗。分別于處理6、12、24、48、72 h及恢復生長4 d后進行取樣測定。

1.2 熱害指數(shù)的測定方法

參照趙大球[20]、羅少波[21]的方法并結(jié)合金蓮花自身在高溫條件下的受損情況劃分等級：

1級：植株正常生長，新葉葉緣稍有反卷，色澤正常；

2級：少于1/5的植株葉片反卷，反卷部分輕度枯萎，能夠正常的生長；

3級：1/5～2/5的植株葉片枯萎，部分植株生長受到影響；

4級：2/5～3/5的植株葉片枯萎，生長受到嚴重抑制；

5級：3/5以上的植株葉片枯萎，莖葉明顯萎縮，生長完全停止。

熱害指數(shù)=∑(各級株數(shù)×熱害等級)/(最高級數(shù)×總株數(shù))×100%

(1)

1.3 指標測定

1.3.1 生理指標測定

葉綠素含量和可溶性糖含量參照李合生等[22]的方法測定；相對電導率參照白寶璋等[23]的方法測定；MDA含量參照張志良等[24]的方法測定；游離脯氨酸(Pro)含量和超氧化物岐化酶活性(SOD)測定參照高俊鳳等[25]的方法。

1.3.2 電阻抗參數(shù)測定

經(jīng)不同濃度的SA處理后，每個處理隨機選取8片葉片，剪成4 mm×10 mm矩形片段，測厚儀(Mitu-toyo No.7331，JaPan)測定其厚度(精確到0.01 mm)。參照RePo等[26]的方法，用電阻抗儀(HP4284A，USA)測定42個頻率下的EIS參數(shù)，利用RePo發(fā)展的LEVM8·06(Macdonald JR)軟件將等效電路參數(shù)采用單一DCE模型進行擬合，得到胞外電阻率(re)、胞內(nèi)電阻率(ri)、弛豫時間(τ)和弛豫時間分布系數(shù)(ψ)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件制圖，SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗熱害指數(shù)的影響

由表1可以看出，晝38℃/夜30℃高溫脅迫下，各處理組的金蓮花幼苗受到不同程度的高溫傷害。隨脅迫時間延長，CK組的熱害級別逐漸增加，脅迫72 h后，葉片開始枯萎，嚴重抑制生長，熱害級別達到4級，熱害指數(shù)也顯著高于各SA處理組(P<0.05)，恢復生長4 d后熱害等級仍為4級，受傷害程度沒有改善。各SA處理組對緩解高溫傷害都有不同程度的效果，脅迫72 h后，4個SA處理中，0.5和1.0 mmol·L-1SA處理的熱害等級最低，熱害指數(shù)顯著低于對照(P<0.05)，分別比對照低26.16%和50.15%，但0.5 mmol·L-1SA處理恢復生長4 d后熱害級別沒有改善，而1.0 mmol·L-1SA處理恢復生長后熱害等級為最低，降到2級，由此可見，噴施1.0 mmol·L-1的SA減輕高溫對金蓮花幼苗傷害的效果最好。

表1 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗熱害指數(shù)的影響

2.2 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗葉綠素總含量的影響

如圖1所示，CK和不同濃度SA處理的金蓮花幼苗葉綠素總含量隨著高溫脅迫時間的延長呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢。經(jīng)不同濃度(0.5～2.0 mmol·L-1)SA處理后的葉片葉綠素總含量均比CK高且差異顯著(P<0.05)。高溫脅迫72 h后，0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1SA處理的金蓮花葉片中的葉綠素含量分別比對照高21.75%、27.59%、20.44%、20.58%，1.0 mmol·L-1SA處理的葉綠素含量顯著高于CK和其他處理，并且在整個脅迫過程中，1.0 mmol·L-1處理的金蓮花葉片葉綠素含量始終高于其他處理，說明此處理對金蓮花幼苗葉綠素降解的緩解效應(yīng)好于其他濃度。

圖1 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗葉綠素總含量的影響Fig.1 Effects of exogenous SA on total chlorophyll content of T.chinensis seedlings under high temperature stress

2.3 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗細胞膜穩(wěn)定性的影響

由圖2可以看出，高溫脅迫條件下，CK和不同濃度SA處理金蓮花幼苗的相對電導率均隨處理時間的延長而升高。高溫脅迫至72 h時，0.5和1.0 mmol·L-1SA處理均顯著低于對照(P<0.05)，兩組處理分別比對照下降7.20%和9.70%。經(jīng)1.5 mmol·L-1處理后電導率低于CK，但與CK組差異不顯著，而經(jīng)2.0 mmol·L-1處理后，其電導值顯著高于CK(P<0.05)。由此可見，噴施0.5和1.0 mmol·L-1可以緩解高溫脅迫，減輕高溫對植物細胞膜結(jié)構(gòu)的損傷。

圖2 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗相對電導率的影響Fig.2 Effects of exogenous SA on relative electric conductivity of T.chinensis seedlings under high temperature stress

如圖3所示，隨著高溫脅迫的推進，CK和各SA濃度處理下金蓮花幼苗葉片的MDA含量均逐漸上升，在所有處理中，CK的MDA含量隨脅迫時間的延長上升的幅度最大，1.0 mmol·L-1SA處理組MDA含量上升的幅度最小。高溫脅迫72 h后，0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1SA處理的金蓮花葉片MDA含量分別比對照下降38.87%、57.26%、16.56%、34.56%，與對照差異顯著(P<0.05)，并且各SA處理組之間差異顯著。1.0 mmol·L-1SA處理組在高溫脅迫過程中MDA含量顯著低于對照及其他處理(P<0.05)。由此可知，高溫脅迫下，適宜濃度的SA能有效地減少MDA含量的積累，減輕高溫對細胞膜脂過氧化的程度。

圖3 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗MDA的影響Fig.3 Effects of exogenous SA on Malondialdehyder of T.chinensis seedlings under high temperature stress

圖4 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗游離脯氨酸的影響Fig.4 Effects of exogenous SA on Proline of T.chinensis seedlings under high temperature stress

2.4 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

如圖4所示，隨著高溫脅迫時間的延長，各處理的金蓮花葉片Pro含量均有不同程度的漲幅。在同一處理時間，隨SA濃度的增加，Pro量先增加后減少，并在1.0 mmol·L-1SA處理達到峰值。高溫脅迫72 h后，1.0 mmol·L-1SA處理的金蓮花葉片Pro含量顯著高于對照及其它處理(P<0.05)，比CK提高30.48%。0.5 mmol·L-1SA處理的Pro含量顯著高于CK(P<0.05)，比CK提高12.47%。SA濃度為1.5～2.0 mmol·L-1時，Pro含量與CK無顯著差異。由此可見，高溫脅迫下，1.0 mmol·L-1SA處理可以顯著提高金蓮花葉片中Pro含量。

由圖5可以看出，各處理的金蓮花葉片可溶性糖含量在6～72 h高溫處理過程中逐漸增加。在同一脅迫時間，可溶性糖含量隨SA濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，SA濃度為1.0 mmol·L-1時可溶性糖含量達到峰值。高溫脅迫72 h后，0.5～2.0 mmol·L-1SA處理均顯著高于對照(P<0.05)，可溶性糖含量分別比對照提高27.40%、49.66%、33.56%、20.89%。其中，1.0 mmol·L-1SA處理顯著高于對照及其他處理(P<0.05)，因此，葉面噴施1.0 mmol·L-1SA能使金蓮花幼苗葉片的可溶性糖含量保持較高的水平，調(diào)節(jié)植物組織滲透勢平衡，有效減輕細胞膜的損傷。

圖5 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗可溶性糖含量的影響Fig.5 Effects of exogenous SA on soluble sugar of T.chinensis seedlings under high temperature stress

圖6 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗超氧化物歧化酶活性的影響Fig.6 Effects of exogenous SA on superoxide dismutase of T.chinensis seedlings under high temperature stress

圖7 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗電阻抗參數(shù)的影響Fig.7 Effects of exogenous SA on electrical impedance parameters of T.chinensis seedlings under high temperature stress

2.5 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

如圖6所示，各處理組金蓮花幼苗葉片的SOD活性隨高溫脅迫時間延長均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，并在脅迫24 h時達到峰值。同一脅迫時間內(nèi)，SOD活性隨SA濃度的增加先升高后降低，1.0 mmol·L-1SA處理SOD活性最高。在高溫脅迫72 h時，1.0 mmol·L-1SA處理SOD活性顯著高于對照及其他處理組(P<0.05)，比對照高22.31%。經(jīng)0.5、1.5 mmol·L-1SA處理后，SOD活性與對照差異不顯著。當SA濃度為2.0 mmol·L-1時，SOD活性顯著低于CK(P<0.05)。由此可見，經(jīng)適宜SA濃度處理后，可使金蓮花幼苗SOD活性增強，而濃度過高時幼苗SOD活性明顯降低，說明高濃度SA會抑制SOD活性。

2.6 外源SA對高溫脅迫下金蓮花幼苗電阻抗參數(shù)的影響

EIS參數(shù)可以反映植物組織細胞的物理化學變化[27]，如圖7所示，各處理組的金蓮花在高溫脅迫過程中，胞外電阻率(re)、胞內(nèi)電阻率(ri)和弛豫時間(τ)等電阻抗參數(shù)的變化趨勢均呈現(xiàn)出先增大后減小，而不同處理的弛豫時間分布系數(shù)(ψ)變化趨勢各不相同。

在6～12 h的高溫脅迫下，各處理胞內(nèi)電阻率(ri)和胞外電阻率(re)均呈現(xiàn)上升趨勢，熱脅迫12 h后，各處理胞內(nèi)電阻率(ri)和胞外電阻率(re)均呈現(xiàn)下降趨勢。高溫脅迫72 h后，0.5、1.0 mmol·L-1SA處理的胞內(nèi)電阻率(ri)值高于CK但無顯著差異，1.5、2.0 mmol·L-1SA處理的胞內(nèi)電阻率(ri)值低于CK，1.5 mmol·L-1SA處理與CK差異不顯著，2.0 mmol·L-1SA處理顯著低于CK(P<0.05)。高溫脅迫至72 h后，0.5、1.0、2.0 mmol·L-1SA處理的胞外電阻率(re)均低于CK且達到顯著性差異(P<0.05)，而1.5 mmol·L-1SA處理后的胞外電阻率(re)顯著高于CK和其他處理(P<0.05)。

在整個脅迫過程中，各處理的弛豫時間均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，CK、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1SA處理均在脅迫12 h時達到峰值，0.5 mmol·L-1SA處理在24 h達到峰值。高溫脅迫至72 h后，經(jīng)0.5、1.0 mmol·L-1SA處理后的弛豫時間(τ)均顯著高于CK和其他處理(P<0.05)，兩者差異不顯著。1.5 mmol·L-1SA處理的弛豫時間(τ)顯著低于CK(P<0.05)，2.0 mmol·L-1SA處理與CK差異不顯著。

各處理的弛豫時間分布系數(shù)(ψ)變化趨勢不同，CK、1.5和2.0 mmol·L-1SA處理隨時間延長呈先上升后下降的趨勢，0.5、1.0 mmol·L-1SA處理則呈先下降后上升的趨勢。高溫脅迫72 h后，0.5、1.0 mmol·L-1SA處理的弛豫時間分布系數(shù)(ψ)與CK無顯著差異，1.5、2.0 mmol·L-1SA處理的弛豫時間分布系數(shù)(ψ)低于CK和其他處理且達到顯著水平(P<0.05)，兩者無顯著差異。

2.7 SA處理下金蓮花幼苗各指標的相關(guān)性分析

由表3可知，熱害指數(shù)與相對電導率呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與葉綠素總量、可溶性糖含量和胞外電阻率(re)呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。胞內(nèi)電阻率(ri)與Pro含量呈正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)達到顯著水平(P<0.05)。弛豫時間(τ)與Pro含量和SOD活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。相對電導率與Pro含量和SOD活性呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。

表3 SA處理下各指標相關(guān)系數(shù)

注：*在0.05水平上顯著相關(guān)；**在0.01水平上極顯著相關(guān)

Note:*significantly correlated at the level of 0.05;**significantly correlated at the level of 0.01

3 討論

高溫脅迫下，熱害指數(shù)是評價植物對高溫逆境的抗性強弱和反映植物受熱傷害程度最直接的指標[28～30]。本研究結(jié)果表明，噴施適宜濃度的SA能夠降低高溫脅迫下金蓮花幼苗的熱害指數(shù)，提高其耐熱性，緩解高溫傷害。這與曹淑紅[31]等對百日草耐熱性、萬正林[32]等對番茄抗高溫效果的研究結(jié)果一致。葉綠素含量是對高溫脅迫反應(yīng)的敏感性生理指標[33]，本研究中表明熱害指數(shù)與葉綠素含量呈顯著負相關(guān)，隨著脅迫時間延長各處理的葉綠素含量呈明顯下降趨勢，但噴施適宜濃度的SA顯著減緩了葉綠素的降解，在一定程度上反映了耐熱能力的提高。

高溫脅迫下，細胞膜系統(tǒng)是受到熱傷害的首要部位，細胞膜透性和MDA含量是反映細胞質(zhì)膜損傷程度的重要指標[34]。本研究中相關(guān)性分析表明熱害指數(shù)與相對電導率呈顯著正相關(guān)，噴施適宜濃度(0.5和1.0 mmol·L-1)的SA處理后相對電導率和MDA含量顯著低于CK，這與李同根[35]等對皖貝母，張月雅[36]等對東北對開蕨的試驗結(jié)論相似，說明噴施適宜濃度的SA能夠有效緩解高溫脅迫對細胞質(zhì)膜的傷害。另外，游離脯氨酸和可溶性糖這些重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)會在植物遭受脅迫時及時做出響應(yīng)，調(diào)節(jié)滲透勢來抵抗逆境，SOD活性的提高有利于防止膜脂過氧化，維持細胞膜穩(wěn)定性[37]，本研究也表明Pro含量和SOD活性與相對電導率呈顯著負相關(guān)，可溶性糖含量與熱害指數(shù)呈顯著負相關(guān)，噴施適宜濃度(1.0 mmol·L-1)的SA能提高金蓮花幼苗葉片的Pro和可溶性糖含量，增加SOD活性，孫軍利[38]、楊嵐[39]等研究水楊酸對高溫脅迫下葡萄、鐵皮石斛耐熱性影響的也有類似的結(jié)果，這說明外源的SA可能通過調(diào)節(jié)金蓮花幼苗葉片的SOD活性、Pro和可溶性糖含量等指標影響細胞膜的穩(wěn)定性，從而提高金蓮花幼苗抵御高溫的能力。

植物能夠自我調(diào)節(jié)來適應(yīng)或抵抗逆境造成的傷害，利用EIS參數(shù)可以記錄植物細胞電阻的變化，測定植物細胞在脅迫下的生理變化[40]，這種測定方法更加高效便捷。本試驗結(jié)果表明，弛豫時間(τ)與Pro含量和SOD活性呈極顯著正相關(guān)，高溫脅迫下，1.0 mmol·L-1SA處理金蓮花幼苗胞外電阻率(re)、胞內(nèi)電阻率(ri)及弛豫時間(τ)均高于對照，可能是噴施適宜濃度的水楊酸能有效降低細胞質(zhì)膜透性，減緩膜脂過氧化，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，從而顯著增加胞內(nèi)胞外黏稠度，增強耐熱性，這與相關(guān)性分析熱害指數(shù)與re呈顯著負相關(guān)，ri與Pro含量呈顯著正相關(guān)的結(jié)果一致。因此，re和ri等電阻抗參數(shù)可作為金蓮花對高溫逆境反應(yīng)的評價指標，通過測定EIS參數(shù)可以了解高溫脅迫對金蓮花幼苗組織膜透性的影響和熱害程度。

綜上所述，外源水楊酸能在高溫環(huán)境中有效地降低金蓮花幼苗的熱害等級和熱害指數(shù)，降低細胞質(zhì)膜透性，減緩膜脂過氧化，緩解葉綠素降解，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和SOD活性，從而提高金蓮花的耐熱性，緩解高溫傷害。電阻抗參數(shù)能有效地表示金蓮花對高溫的反應(yīng)，可作為快速估測高溫脅迫下金蓮花幼苗組織內(nèi)部生理變化的一種方法，從而檢測高溫傷害。在栽培生產(chǎn)中，夏季高溫環(huán)境下對金蓮花幼苗葉片適宜噴施1.0 mmol·L-1的SA，以緩解高溫對金蓮花幼苗的傷害。