佟晶晶，施克新，冷 飛，李鳳萍

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)葫蘆島市中心醫(yī)院 研究生培養(yǎng)基地，遼寧 葫蘆島 125000；2.葫蘆島市中心醫(yī)院 內(nèi)分泌科，遼寧 葫蘆島 125000)

糖尿病(DM)是一種以血漿葡萄糖升高為特征的復(fù)雜慢性代謝性疾病。中國DM患病率從1980年的0.67%上升至2013年的10.4%，居世界首位[1]。本病與多種并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)，其多重并發(fā)癥給患者帶來了巨大負(fù)擔(dān)。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是DM最具破壞性的微血管并發(fā)癥之一，在全球35個(gè)研究中心進(jìn)行的基于流行病學(xué)的薈萃分析顯示，DR在DM總?cè)丝谥械幕疾÷蕿?5.4%[2]，它主要影響工作年齡的成年人，是該年齡段失明的主要原因。

DR是DM終末器官損害的眼部表現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，主要是由于在遺傳基礎(chǔ)上，長期高血糖導(dǎo)致視網(wǎng)膜多元醇通路活性增加、蛋白激酶C途徑及己糖胺途徑的激活、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的產(chǎn)生以及聚(ADP)-核糖聚合酶上調(diào)等，進(jìn)而導(dǎo)致局部血管的氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)。OS在DR的發(fā)病機(jī)理中起著至關(guān)重要的作用。OS可引起內(nèi)皮功能障礙，這是DM微血管并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展最重要的機(jī)制。由于部分DR臨床表現(xiàn)不明顯，容易被忽視。因此，早期檢測、早期診斷和早期治療至關(guān)重要，以便及時(shí)采取干預(yù)措施。在臨床上如果能找到簡單有效的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)，在有高危風(fēng)險(xiǎn)的患者中進(jìn)行上述眼底篩查，對(duì)早期檢測DR將有一定的幫助，并且可以有效減輕患者的痛苦和心理負(fù)擔(dān)。

膽紅素是血紅素分解代謝的主要產(chǎn)物，是人體內(nèi)較強(qiáng)的天然抗氧化劑，對(duì)微血管具有抗氧化和抗炎作用。膽紅素能夠清除氧自由基、抑制低密度脂蛋白及脂質(zhì)的過氧化。Jayanthi等[3]發(fā)現(xiàn)總膽紅素(TBIL)可作為預(yù)測2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM)合并有亞臨床甲狀腺疾病患者胰島素抵抗進(jìn)展的早期生化指標(biāo)和臨床指標(biāo)，主要是由于膽紅素的抗氧化特性。此外，膽紅素的測定與其他標(biāo)記物相比無疑是廉價(jià)的，而且是常規(guī)檢查項(xiàng)目，臨床醫(yī)生很容易獲得。本研究旨在探討血清膽紅素水平對(duì)DR的影響，為DR的防治及延緩其進(jìn)展提供參考及新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2018年10月至2019年12月在葫蘆島市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的2型糖尿病(T2DM)患者293例(均符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn))，男143例，女150例。平均年齡(59.62±10.98)歲，平均病程(13.37±5.02)年。為保障患者的知情同意權(quán)，此項(xiàng)研究數(shù)據(jù)的采用均經(jīng)過患者本人及家屬同意，所有數(shù)據(jù)匿名分析，并取得了醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。病例排除情況：特殊類型DM患者、1型糖尿病以及合并DM急性并發(fā)癥患者；血清膽紅素異常、肝功能異常[ALT和(或)AST>40 U/L]或存在肝膽疾病者及腎功能異常者(肌酐>97 μmol/L)；明顯缺氧、心肺功能不全，處于應(yīng)激狀態(tài)的患者(嚴(yán)重創(chuàng)傷、手術(shù)、心血管事件等)；急慢性感染者；腫瘤性疾病、營養(yǎng)不良、貧血者；合并自身免疫性疾病及其它系統(tǒng)性、活動(dòng)性疾病、代謝性疾病患者以及患甲亢、垂體瘤等疾病的患者；近3個(gè)月曾服用激素、免疫抑制劑者；口服除降糖以外影響血糖的藥物者；合并有其他眼底病變，或因屈光間質(zhì)混濁無法看清眼底者；曾行視網(wǎng)膜手術(shù)和激光治療者。

1.2研究分組 參照1984年全國眼科學(xué)術(shù)會(huì)議通過的DR的分期標(biāo)準(zhǔn)[4]，Ⅰ期：微血管瘤，小出血點(diǎn)；Ⅱ期：出現(xiàn)硬性滲出；Ⅲ期：出現(xiàn)棉絮狀軟性滲出；Ⅳ期：新生血管形成，玻璃體積血；Ⅴ期：纖維血管增殖、玻璃體機(jī)化；Ⅵ期：牽拉性性視網(wǎng)膜脫離、失明。Ⅰ～Ⅲ期為非增生型DR(NPDR)，Ⅳ～Ⅵ期為增生型DR(PDR)。將所有受試對(duì)象依據(jù)眼科檢查結(jié)果分為NDR、NPDR及PDR3組。依據(jù)TBIL水平四分位數(shù)分組，依據(jù)Q1、Q2、Q3和Q4分成4組。

1.3資料收集 符合入選標(biāo)準(zhǔn)的T2DM 患者293例，病案室借閱病例檔案。收集患者資料，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、病程，體重指數(shù)(BMI)(BMI=體重(kg)/身高(cm)2)。

1.4實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測 應(yīng)用羅氏全自動(dòng)生化分析儀測定FPG、2 hPG、TBIL、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素( IBIL)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GGT)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇( LDL-C)及肌酐；應(yīng)用羅氏全自動(dòng)免疫分析儀測定空腹C-肽(fasting C-peptide, FCP)、餐后2小時(shí)C-肽(C-peptide 2 hours meal, 2 h-CP)；應(yīng)用愛科來全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀測定糖化血紅蛋白(HbA1c)。采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖；采用重氮法檢測TBIL、DBIL和IBIL；采用酶法檢測ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL、γ-GGT及肌酐；采用高效液相色譜層析法檢測HbA1c；采用電化學(xué)發(fā)光法檢測C肽。

1.5眼底檢查 所有患者入院后第2天進(jìn)行系統(tǒng)的眼科檢查，暗室內(nèi)應(yīng)用日本KOWA免散瞳眼底照相機(jī)進(jìn)行拍攝55°以黃斑為中心的視網(wǎng)膜彩色圖像，每只眼睛拍攝1張照片，攝片后將彩色圖像傳輸?shù)接?jì)算機(jī)并打印，眼底攝片不清或肉眼觀病變超過Ⅲ期的患者，由眼科醫(yī)師散瞳檢查或行眼底血管熒光造影檢查，之后由有經(jīng)驗(yàn)的眼科醫(yī)師進(jìn)行DR篩查和分期。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分類變量和連續(xù)性變量分別采用頻數(shù)/百分比和均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，分類變量組間比較采用卡方檢驗(yàn)，滿足正態(tài)分布和方差齊性的連續(xù)性變量組間比較采用方差分析，偏態(tài)分布和方差不齊的連續(xù)性資料組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間比較分析采用SNK法。采用多元有序Logistic回歸分析DR的危險(xiǎn)因素。血清TBIL水平分為四分位數(shù)組間比較采用卡方檢驗(yàn)。TBIL與其他指標(biāo)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1一般臨床資料比較 與NDR組比較，NPDR組和PDR組中的病程、收縮壓均升高(P<0.05)，且PDR組中的病程、收縮壓高于NPDR組(P<0.05)。3組患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史及BMI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 與NDR組比較，NPDR組和PDR組中TBIL、DBIL、2 h-CP均減低，且PDR組中TBIL、DBIL、IBIL、2 h-CP低于NPDR組(P<0.05)。與NDR組比較，PDR組中IBIL低于NDR組(P<0.05)。與NDR組比較，NPDR組和PDR組中FPG、2 hPG、HbA1c、TC均升高(P<0.05)，且PDR組中FPG、2 hPG、HbA1c、γ-GGT高于NPDR組(P<0.05)。與NDR組比較，PDR組中γ-GGT高于NDR組(P<0.05)。FCP、ALT、AST、HDL、LDL、TG及肌酐3組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3DR多元有序Logistic回歸分析 根據(jù)單因素分析結(jié)果將P<0.05的變量納入有序Logistic回歸模型，結(jié)果顯示：TBIL和2 h-CP是DR的保護(hù)性因素；病程、SBP、FPG、2 hPG、HbA1c、γ-GGT是DR的危險(xiǎn)因素。見表3。

2.4不同總膽紅素水平DR的患病率 依據(jù)TBIL水平將所有患者分為4組：Q1組(<7.8 μmol/L)、Q2組(7.8～10.1 μmol/L)、Q3組(10.1～12.65 μmol/L)和Q4組(>12.65 μmol/L)，各組DR患病率分別為68.1%、63.3%、43.1%和26.0%；4組患病率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各組間進(jìn)行比較，與Q1組相比，Q3組DR的患病率顯著降低(P=0.003)，Q4組患病率亦顯著降低(P<0.01)；與Q2組相比，Q4組的患病率顯著降低(P<0.01)；其余差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4組DR患病率存在差異，DR的患病率隨著TBIL水平的升高而降低。見表4，圖1。

表1 3組一般臨床資料比較

注：與NDR組比較，*P<0.05，與NPDR 組比較，#P<0.05

表2 3組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

注：與NDR組比較，*P<0.05，與NPDR比較，#P<0.05

表3 DR多元有序Logistic回歸分析

注：平行性檢驗(yàn)P=0.07，滿足多元有序logistic回歸假設(shè)

表4 不同TBIL四分位數(shù)分組DR的患病人數(shù)及患病率[例(%)]

注：χ2=32.807，P<0.01。與<7.8比較，*P<0.05；與7.8～10.1比較，#P<0.05

2.5TBIL與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明：TBIL分別與SBP、FPG、2 hPG、HbA1c呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與2 h-CP呈正相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 TBIL與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析

圖1 TBIL四分位數(shù)分組DR患病率
注：*表示兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討 論

DM是一種影響血糖水平穩(wěn)態(tài)的慢性代謝性疾病，在發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家都是一個(gè)日益嚴(yán)重的健康問題[5-6]。DR是DM最常見且嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一。世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布DR是第五大失明原因，也是可預(yù)防性失明的重要原因之一[7]。在適當(dāng)管理下，90%以上由DR引起的視力喪失是可以避免的。因此，在臨床實(shí)踐中，尋找一種簡便易行的指標(biāo)來預(yù)測DR的發(fā)生與發(fā)展具有重要的臨床價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)中的膽紅素指標(biāo)作為OS的生理性調(diào)節(jié)因子，近年來，在DM患者中引起廣泛關(guān)注。

DR的發(fā)生是許多因素共同作用的結(jié)果，如上述提到其潛在機(jī)制是長期暴露于高血糖和血糖控制不良的狀態(tài)下，激活了5個(gè)關(guān)鍵的生化途徑，導(dǎo)致局部血管的OS并產(chǎn)生活性氧。視網(wǎng)膜微脈管系統(tǒng)受到OS的影響，其附近細(xì)胞的選擇性減少而產(chǎn)生微動(dòng)脈瘤，并且由于內(nèi)皮素-1合成減少，引起血管眼底膜增厚、微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管通透性增加和血管閉塞，導(dǎo)致NPDR的形成；隨著病程進(jìn)一步加重，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞凋亡以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生，VEGF在促進(jìn)血管生成和血管通透性方面起著關(guān)鍵作用，還可介導(dǎo)對(duì)血管的有害影響[8]。同時(shí)有研究顯示炎癥及血管纖維化也是DR發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制[9]，因此VEGF的及其他炎癥和血管纖維化等相關(guān)趨化因子過度表達(dá)促進(jìn)了視網(wǎng)膜新生血管形成和血-視網(wǎng)膜屏障完整性的喪失，最終導(dǎo)致PDR，在嚴(yán)重情況下會(huì)誘發(fā)黃斑水腫，甚至失明。

膽紅素是由血紅素加氧酶和膽綠素還原酶對(duì)血紅素的順序催化降解而產(chǎn)生的[10]。近年來研究表明，生理水平范圍內(nèi)的膽紅素水平與DM大血管和微血管并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)[11-14]。主要由于生理濃度下高水平的膽紅素具有潛在的抗氧化活性，特別是在疏水性細(xì)胞膜中，膽紅素比谷胱甘肽更能保持細(xì)胞膜中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[15-16]。研究顯示，在瘦素受體缺乏、飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中，膽紅素可提高胰島素的敏感性，改善肥胖癥，并可抑制慢性炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[17]。膽紅素還通過降低瘦素、血糖和膽固醇濃度，對(duì)飲食誘發(fā)的肥胖小鼠產(chǎn)生有益作用。從而發(fā)揮對(duì)DM和代謝綜合征的保護(hù)作用[18-19]。此外，血清膽紅素水平與葡萄糖代謝狀態(tài)有關(guān)，在空腹血糖受損和新發(fā)的T2DM患者中，血清膽紅素的水平較高，但隨著DM時(shí)間的延長而降低。先前的觀察性研究表明，膽紅素的升高使人類患DM的風(fēng)險(xiǎn)降低26%～31%[20-21]，Abbasi等[22]對(duì)3 381例前瞻性隊(duì)列參與者進(jìn)行孟德爾隨機(jī)研究，使用位于UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT1A1)的rs6742078，發(fā)現(xiàn)TBIL升高與DM患病風(fēng)險(xiǎn)存在因果關(guān)系，并證明其具有保護(hù)性作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患有視網(wǎng)膜病變患者的TBIL、DBIL和IBIL水平顯著低于無視網(wǎng)膜病變的患者，同時(shí)PDR患者的TBIL、DBIL和IBIL水平低于NPDR患者的血清膽紅素水平，根據(jù)上述所述考慮其原因可能為DM患者長期處于高糖狀態(tài)下，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，而膽紅素作為抗氧化劑，不斷被消耗，使人體內(nèi)膽紅素逐漸降低，進(jìn)而導(dǎo)致DR的發(fā)病，以及促進(jìn)DR的進(jìn)一步發(fā)展。我們進(jìn)一步行多元有序Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)TBIL水平的升高是DR的保護(hù)性因素，TBIL每減少1 μmol/L，DR嚴(yán)重程度的增加是原來的0.85倍(95%CI0.784-0.921)。這與Karuppannasamy和Ghaffar等[23-24]研究結(jié)果相似。本研究又進(jìn)一步以血清TBIL四分位數(shù)進(jìn)行分組，4組間DR患病率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且組間比較提示隨著TBIL濃度的降低，DR的患病率逐漸升高。由此推斷TBIL水平的降低促進(jìn)了DR的進(jìn)一步發(fā)展，在低血清膽紅素水平的T2DM患者中，應(yīng)更加關(guān)注DR發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)于膽紅素對(duì)DR的保護(hù)機(jī)制，可能包括以下幾個(gè)方面：①抗氧化：膽紅素比維生素E類似物和谷胱甘肽更能防止低密度脂蛋白及脂質(zhì)過氧化，與氧化應(yīng)激標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)，與超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等抗氧化酶活性呈正相關(guān)[25]。因此，較低的血清膽紅素濃度會(huì)增加OS，促進(jìn)DR的發(fā)展。②抗炎作用：膽紅素可通過抑制腫瘤壞死因子介導(dǎo)的黏附分子的上調(diào)，具有抗炎作用，且膽紅素與C-反應(yīng)蛋白呈負(fù)相關(guān)[24]。因此，可以推測血清TBIL水平越高，其抗炎能力越強(qiáng)，越能降低DR發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，延緩其進(jìn)展。③改善視網(wǎng)膜內(nèi)皮功能：一項(xiàng)動(dòng)物研究表明：通過內(nèi)源性合成或外源性給藥增加血清膽紅素水平，可通過激活蛋白激酶B來改善DM患者視網(wǎng)膜的內(nèi)皮功能障礙[26]。

此外本研究發(fā)現(xiàn)，從T2DM進(jìn)展到NPDR甚至發(fā)展為PDR，2 h-CP的水平逐漸降低，進(jìn)一步行Logistic回歸分析提示2 h-CP水平的降低是DR的危險(xiǎn)因素。表明C肽對(duì)T2DM患者視網(wǎng)膜病變的有益影響。Lim等[27]研究表明，C肽通過抑制活性氧的產(chǎn)生、應(yīng)力纖維的形成、VE-鈣黏蛋白的破壞以及血管通透性的增加，證明了其對(duì)VEGF誘導(dǎo)的糖尿病小鼠視網(wǎng)膜微血管滲漏潛在的保護(hù)性作用。在相關(guān)分析中，我們發(fā)現(xiàn)TBIL與2 h-CP存在著正相關(guān)的關(guān)系?？紤]原因?yàn)槟懠t素通過其抗氧化作用在β細(xì)胞損傷中起到保護(hù)作用[28]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，病程、血糖、HbA1c在NDR、NPDR及PDR 3組之間存在顯著差異，Logistic回歸分析提示病程、血糖、HbA1c是DR的危險(xiǎn)因素。同時(shí)在相關(guān)性分析中，我們發(fā)現(xiàn)TBIL與血糖、HbA1c呈負(fù)相關(guān)。隨著DM病程延長，患者往往伴隨多種并發(fā)癥的發(fā)生，T2DM并發(fā)的慢性眼病在早期DM患者中更為常見，早發(fā)作T2DM患者的DR患病率高于晚發(fā)者[29]。近年來，高血糖“代謝記憶”成為DM研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題，患者高血糖時(shí)間越長，越容易患微血管疾病，高血糖對(duì)微血管的損傷可在降低血糖后持續(xù)較長時(shí)間[30]。眾所周知，HbA1c是一種可靠的慢性高血糖的標(biāo)志物，有效的血糖控制與降低HbA1c的水平有關(guān)。研究報(bào)道HbA1c水平超過7%，反映了長期血糖控制不良，對(duì)視網(wǎng)膜微血管的損傷有重要影響[29-31]。HbA1c的形成與OS的增加顯著相關(guān)，血清TBIL的升高可通過降低OS而抑制血紅蛋白的糖基化，降低DR發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[23]。

此外，在Logistic回歸分析中我們發(fā)現(xiàn)SBP也是DR的危險(xiǎn)因素，提示SBP的升高可增加DR的患病風(fēng)險(xiǎn)，有橫斷面研究顯示，由于血壓異常可增加血流剪切應(yīng)力，破壞DM患者視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，因此在DM和高血壓患者中，更嚴(yán)格的控制血壓可能有助于預(yù)防DR的發(fā)生[32]。Spearman研究結(jié)果顯示TBIL與SBP存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系，表明SBP越高，可進(jìn)一步加重TBIL的缺乏狀態(tài)，從而進(jìn)一步增加DM患者患視網(wǎng)膜病變的風(fēng)險(xiǎn)。在Logistic回歸分析中我們還發(fā)現(xiàn)γ-GGT也是DR的危險(xiǎn)因素，最近國內(nèi)外研究報(bào)道，γ-GGT直接參與活性氧的形成，被認(rèn)為是OS的獨(dú)立指標(biāo)，γ-GGT水平的升高增加了糖尿病周圍神經(jīng)病變和代謝綜合征的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[33-34]。結(jié)合本研究結(jié)果可推斷，γ-GGT通過參與氧化應(yīng)激過程促進(jìn)DR的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，生理水平范圍內(nèi)的血清TBIL水平的升高可以有效地延緩或阻斷DR的發(fā)生及NPDR進(jìn)展到PDR的過程，可作為評(píng)估DR風(fēng)險(xiǎn)的潛在性生物標(biāo)志物。2 h-CP水平的降低可能協(xié)同參與了DR的發(fā)生發(fā)展；臨床上當(dāng)DM患者出現(xiàn)病程、血糖、HbA1c、SBP、γ-GGT的升高，我們應(yīng)該警惕DR的發(fā)生，特別要警惕PDR的發(fā)病，提高糖尿病患者生存質(zhì)量，降低DM患者致殘、致死率。