顧曉曉，鄔琴，陶喬孝慈 ，馬雪，李劼，韓猛立，周 霞*，黃新，吳桐忠，張星星，鐘發(fā)剛

(1. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000；2. 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003

大腸桿菌是一種具有重要公共衛(wèi)生意義的人畜共患病病原[1]，可分為腸道內(nèi)和腸道外致病性大腸桿菌。腸道內(nèi)大腸桿菌常引起腸道感染和病變，導(dǎo)致食欲不振、吸收功能障礙、排便失常等；腸道外致病性大腸桿菌則可引起多種動(dòng)物腸道以外的多個(gè)臟器的病變，如腦炎、尿道炎、敗血癥等。獸醫(yī)臨床常見有犢牛腦炎、肺炎等[2]。

細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性除了與攜帶眾多的耐藥基因有關(guān)外，生物被膜(biofilm, BF)是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的另外一個(gè)重要原因。細(xì)菌依靠靜電力以特異或非特異性方式黏附到細(xì)胞間和支撐物表面，與各類代謝產(chǎn)物結(jié)合形成大量不易溶解的細(xì)胞外聚合物(EPS)，可抑制吞噬細(xì)胞和補(bǔ)體系統(tǒng)的激活作用，抵抗宿主免疫系統(tǒng)。因此，BF的產(chǎn)生能大大增強(qiáng)細(xì)菌的致病性以及耐藥性[3-6]。研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的大腸桿菌能不同程度地形成BF[7]。

近年來，隨著新疆養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，由大腸桿菌引發(fā)的犢牛腦炎時(shí)有發(fā)生，給畜牧業(yè)造成一定的損失。實(shí)驗(yàn)室從發(fā)生腦炎的犢牛大腦中分離鑒定了1株大腸桿菌，但對該菌株產(chǎn)生BF的能力及其影響因素未進(jìn)行研究。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，采用細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)合結(jié)晶紫染色法分析分離株產(chǎn)生BF的能力以及不同培養(yǎng)條件對BF產(chǎn)生的影響，為研究該病原形成BF的理論體系提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室從發(fā)生腦炎的犢牛大腦中分離鑒定，經(jīng)測序比對與大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CP054227.1相似度達(dá)99.72%；產(chǎn)BF能力較強(qiáng)的禽致病性大腸桿菌，由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。

1.2 主要試劑與儀器

LB、BHI、TSB培養(yǎng)基、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和結(jié)晶紫染液等相關(guān)試劑，均購自廣州東盛生物科技有限公司；常規(guī)的儀器均由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 分離株BF形成能力的測定

取40 μL菌液加入裝有160 μL LB培養(yǎng)基的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后用PBS反復(fù)沖洗，加入結(jié)晶紫染液染色，用純化水洗滌后放入烘箱中烘干，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。后再加入乙醇-丙酮(4∶1的比例)于96孔板進(jìn)行脫色，酶標(biāo)儀檢測OD595值，取3個(gè)平行樣，記錄平均值，采用GraphPad prism軟件進(jìn)行單因素方差分析，利用實(shí)驗(yàn)室分離到的一株形成BF能力較強(qiáng)的禽致病性大腸桿菌作為對照組與分離株作比較。

BF形成能力的鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[8]。依據(jù)臨界(ODC)值(ODC等于空白對照孔的平均值加上其3倍的標(biāo)準(zhǔn)差)，BF形成能力可分類為：OD≤ODC為不形成生物被膜，ODC4ODC為強(qiáng)生物被膜形成。

1.4 培養(yǎng)時(shí)間對分離株BF形成的影響

設(shè)定不同的培養(yǎng)時(shí)間(6、12、24、36、48及72 h)，培養(yǎng)結(jié)束后，用1.3的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察以及OD595值的測定。

1.5 不同成分對分離株BF形成能力的影響

取適量菌液，加入含有不同濃度葡萄糖(1%、2%、3%、5%)、不同濃度的蔗糖(1%、2%、3%、5%)、不同濃度NaCl(0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)的液體培養(yǎng)基，用1.3的培養(yǎng)方式培養(yǎng)至BF形成的最佳時(shí)間進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察以及OD值的測定。

1.6 不同培養(yǎng)基對分離株BF形成的影響

按1.3的培養(yǎng)方式取適量菌液加入相應(yīng)液體培養(yǎng)基(LB、BHI、TSB)，在培養(yǎng)的最佳時(shí)間進(jìn)行BF形態(tài)學(xué)的觀察以及OD值的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株BF形成能力的測定

禽源大腸桿菌可見菌體呈現(xiàn)散落的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有形成緊密的相對完整BF結(jié)構(gòu)(圖1A)；分離株在24 h可見形成間斷的細(xì)線狀的BF，結(jié)構(gòu)較為松散，無明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖1B)；分離株OD值在ODC

2.2 分離株形成BF最佳時(shí)間的測定

6 h時(shí)開始有BF形成但形成量較少，初步形成呈零星的點(diǎn)狀的BF；6～24 h的OD值逐漸升高，12 h時(shí)可見零星短線狀的BF；24～36 h的OD值仍處于上升趨勢，但上升幅度不大，24 h形成間斷的細(xì)線狀的BF較為松散，36 h形成稍粗線狀的BF和較多的短桿狀的結(jié)構(gòu)；36～48 h的OD值趨于平穩(wěn)，BF的形成量已到達(dá)頂峰，48 h形成了連續(xù)的線條狀的BF且點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)較為密集；48 h以后OD值迅速下降，形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為松散不緊密。結(jié)果顯示分離株形成BF的最佳時(shí)間為48 h，見圖2。

圖1 禽致病性大腸桿菌(A)與致犢牛腦炎大腸桿菌(B)培養(yǎng)24 h的形態(tài)(400×)

圖2 致犢牛腦炎大腸桿菌BF在不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)OD595值的測定

2.3 不同成分對分離株BF形成的影響

(1)不同濃度葡萄糖對BF的影響

隨著葡萄糖濃度的升高，BF的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸完整，OD595值逐漸升高；當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到3% 時(shí)BF形態(tài)最為完整，OD595值最大，極顯著高于其他3組(P<0.001)，其余三組間無顯著性差異(P>0.05)；隨著糖濃度的繼續(xù)升高BF結(jié)構(gòu)逐漸松散，且OD595呈下降趨勢，見圖3。

圖3 致犢牛腦炎大腸桿菌BF在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)基中OD595值的測定

(2)不同濃度蔗糖對分離株BF形成的影響

隨著蔗糖濃度的升高BF的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸完整。當(dāng)濃度達(dá)到1%時(shí)，BF的形態(tài)最佳，OD595最大,極顯著高于其他3組(P<0.001)，其余三組間無顯著性差異(P>0.05)；隨著蔗糖濃度的繼續(xù)增加，BF結(jié)構(gòu)逐漸松散，且OD595呈下降趨勢，見圖4。

圖4 致犢牛腦炎大腸桿菌BF在不同濃度蔗糖培養(yǎng)基中OD595值的測定

(3)不同濃度NaCl對分離株BF形成的影響

隨著NaCl濃度的升高，BF的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸松散。當(dāng)濃度達(dá)到0.5%時(shí)，BF形態(tài)最為完整,極顯著高于0%和0.5%組(P<0.001)，1%組顯著高于1.5%和2%組(P<0.05)。隨著NaCl濃度繼續(xù)增加，BF的形態(tài)逐漸松散，此時(shí)OD595呈下降趨勢，見圖5。

圖5 致犢牛腦炎大腸桿菌BF在不同濃度NaCl中OD595值的測定

2.4 分離株BF在不同培養(yǎng)基中的測定

48 h時(shí)，分離株BF在LB培養(yǎng)基中OD595值最大，顯著高于其他兩種培養(yǎng)基(P<0.05)，形態(tài)最為完整；在BHI培養(yǎng)基中BF形成的OD值最小，最為松散；TSB培養(yǎng)基中測得的OD值趨于二者之間，見圖6。

圖6 致犢牛腦炎大腸桿菌BF在不同培養(yǎng)基中OD595值的測定

3 討論

BF是一種在自然條件下生長在物體表面的細(xì)菌形成的自我保護(hù)狀態(tài)，可以使細(xì)菌的耐藥性增加，且能很好抵抗氧化應(yīng)激、脫水和饑餓等不良因素而間接增強(qiáng)細(xì)菌的毒力[9]。生物膜形成涉及四個(gè)主要步驟：初始粘附或附著(可逆)；生物膜結(jié)構(gòu)的早期形成(不可逆轉(zhuǎn))；已形成的生物膜成熟和細(xì)菌從生物膜中分散以恢復(fù)浮游狀態(tài)[10-11]。成熟的生物被膜結(jié)構(gòu)由外到內(nèi)依次是主體生物被膜層、連接層、條件層和基質(zhì)層[12-13]。一旦細(xì)菌開始分泌細(xì)胞外多糖物質(zhì)(EPS)，就會(huì)進(jìn)入生物膜的第二階段發(fā)展，這是一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的過程。EPS的分泌是連續(xù)的，直到形成第三階段，確保細(xì)菌在厚的復(fù)雜生物分子層內(nèi)的表面安全附著。生物膜通過吞噬細(xì)胞和補(bǔ)體系統(tǒng)的受損激活保護(hù)入侵細(xì)菌免受宿主免疫系統(tǒng)的影響，并且還使其對常規(guī)抗生素的抗性增加約1 000倍。BF的形狀、緊密度和厚度根據(jù)細(xì)菌類型和環(huán)境條件而變化[14]。研究表明不同來源大腸桿菌產(chǎn)生BF的能力不同，很多分離株體外培養(yǎng)大腸桿菌在24-32 h時(shí)即能形成穩(wěn)定的BF[15]。與本實(shí)驗(yàn)室分離保存的禽致病性大腸桿菌相比在相同的培養(yǎng)條件下，本試驗(yàn)菌株BF形成能力較弱，即BF形態(tài)較為松散，BF網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不完整，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間在36-48 h時(shí)才形成形態(tài)相對完整的BF。而前期研究表明本試驗(yàn)菌株能引起犢牛腦炎，動(dòng)物感染試驗(yàn)也表明其具有較強(qiáng)致病性。因此與致病性相關(guān)的其他主要因素還需進(jìn)一步研究。

研究表明，營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的突然變化可以誘導(dǎo)生物膜擴(kuò)散。在銅綠假單胞菌的試驗(yàn)中，由于碳底物可用性的突然降低和突然增加，發(fā)現(xiàn)在基本培養(yǎng)基中生物膜產(chǎn)生分散[16]。當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)稀缺時(shí)，細(xì)胞可能脫離以逃避不利條件，或者當(dāng)營養(yǎng)充足時(shí)，可選擇將代謝能量投入生殖和分離。在熒光假單胞菌中，饑餓誘導(dǎo)了外多糖裂解酶產(chǎn)生和生物膜分散的增加，而在銅綠假單胞菌中，藻酸鹽裂解酶活性在快速生長的細(xì)胞中被最大程度地誘導(dǎo)[17]。同樣，這兩個(gè)結(jié)果表明，在有利和不利條件下都可能出現(xiàn)增加生物膜擴(kuò)散速率。在非假單胞菌中，營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致增加水生嗜水氣單胞菌中的生物膜分散，而高營養(yǎng)條件誘導(dǎo)生物膜在環(huán)境不動(dòng)桿菌中擴(kuò)散[18]。在大腸桿菌中，外源葡萄糖阻斷了CsrA誘導(dǎo)的生物膜分散，CsrA是中心碳通量的全球調(diào)節(jié)劑，進(jìn)一步支持營養(yǎng)條件可誘導(dǎo)生物膜擴(kuò)散的假設(shè)[19]。陶健等[20]在M63培養(yǎng)基中添加3%葡萄糖培養(yǎng)大腸桿菌72 h時(shí)形成BF的量最高。本試驗(yàn)中分離株在LB培養(yǎng)基中添加3%的葡萄糖有利于大腸桿菌BF的形成，而糖濃度繼續(xù)增高不利于分離株BF的產(chǎn)生。關(guān)于葡萄糖對BF形成的影響有著不同的報(bào)道，KRISTICH等[21]報(bào)告了增加葡萄糖濃度會(huì)產(chǎn)生抑制作用，而BALDASSARRI等[6]則報(bào)道了在0.5%葡萄糖下形成了完整的生物膜，PILLAI等[22]報(bào)道了濃度<1%時(shí)是增強(qiáng)作用，0.5%是最適濃度。適當(dāng)濃度NaCl可以促進(jìn)BF的形成[23-24]，但隨含量的升高均表現(xiàn)出BF的形成受抑制現(xiàn)象。本研究結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)。LB、BHI、TSB三種培養(yǎng)基相較而言，BHI和TSB培養(yǎng)基比LB培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分豐富，而LB中BF形成最佳，因此營養(yǎng)物質(zhì)的相對匱乏有利于BF的形成。