劉麗婭，葉鋒，馬曉菁，谷文喜，謝彩云，鐘旗，易新萍

(新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學院動物臨床醫(yī)學研究中心，新疆 烏魯木齊 830000)

布魯菌病(Brucellosis，簡稱布病)是由布魯菌引起的一種慢性人畜共患傳染病，在國內外廣泛流行，至今已在170 多個國家和地區(qū)均有報道發(fā)生或正在發(fā)生[1-2]。自上世紀90 年代以來，受多種因素的影響，我國布病呈現出明顯上升的發(fā)病趨勢，流行范圍有明顯擴大的趨勢[3]。近幾年來雖然維持在一個相對較穩(wěn)定水平，但總體來看，每年的發(fā)病數量仍然較高，未呈現顯著性下降態(tài)勢[4]。

快速、準確的診斷方法及檢測產品是有效開展布病防控工作的基礎。根據國標GB/T18646-2018 的規(guī)定，競爭酶聯免疫吸附試驗(cELISA)可適用于牛種、羊種和豬種布魯菌病的血清學確診。本研究選擇在市面上銷售，具有正規(guī)生產批文批號的4種不同廠家生產的商品化布魯菌病cELISA抗體檢測試劑盒，對經英國參考實驗室APHA競爭性ELISA試劑盒檢測確定陰陽性的牛、羊血清樣品進行檢測，比較、分析檢測結果間差異，探討這4種不同廠家試劑盒的檢測效果，以期為布病臨床診斷試劑的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

根據國標GB/T18646-2018 的規(guī)定，以英國參考實驗室APHA競爭性ELISA試劑盒檢測結果為確診標準，對新疆地區(qū)養(yǎng)殖場(戶)采集的牛、羊血清樣品進行檢測，篩選出52份陽性、38份陰性共90份牛血清，42份陽性、34份陰性共76份羊血清，開展本研究工作。

1.1.2 診斷試劑

英國參考實驗室APHA競爭性ELISA試劑盒，批號為C223-17； A試劑盒：北京某公司cELISA布魯菌抗體檢測試劑盒,批號為18040308G；B試劑盒：蘭州某公司布魯菌cELISA抗體檢測試劑盒，批號為20170930130；C試劑盒：深圳某公司布魯菌病抗體檢測試劑盒，批號為2018030902；D試劑盒：武漢某公司布魯菌cELISA抗體檢測試劑盒，批號為180502。所有試劑盒均在有效期內。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本檢測和結果判定

5種試劑盒均嚴格按照其說明書進行試驗操作及結果判定。

1.2.2 檢測結果差異性分析

按公式敏感性(Se)=a/(a+c)，特異性(Sp)=d/(b+d)，假陽性率=b/(b+d)，假陰性率=c/(a+c)，計算兩種檢測試劑的敏感性、特異性、假陽性率、假陰性率[5]。按照公式計算一致性系數(Kappa)=2(ad-bc)/(p1q2+p2q1)，計算4種試劑盒與英國參考實驗室APHA競爭性ELISA試劑盒檢測結果間的Kappa值[6]，比較其符合程度。公式中字母含義及計算方法見表1。

Kappa值為0.81～1.00 時，判定兩種方法完全符合；為0.61～0.80 時，判定兩種方法高度符合；為0.41～0.60 時，判定兩種方法中度符合；為0.21～0.40 時，判定2種方法比較符合；0.20 以下為輕度符合；0 以下為不符合。

表1 敏感性、特異性及一致性系數試驗

項目英國參考實驗室APHA競爭性ELISA試劑盒陽性陰性合計某廠家cELISA試劑盒陽性abp1=a+b陰性cdq1=c+d合計p2=a+cq2=b+dn

2 結果

2.1 cELISA檢測

以英國參考實驗室APHA競爭性ELISA試劑盒檢測結果為確診標準，確定牛陽性血清52份、牛陰性性血清38份；羊陽性血清42份、羊陰性性血清34份。

應用A、B、C、D四個不同廠家生產的商品化布魯菌cELISA抗體檢測試劑盒對上述樣品進行檢測。A試劑盒檢出牛陽性血清67份、陰性血清23份，羊陽性血清49份、陰性性血清27份；B試劑盒檢出牛陽性血清66份、陰性性血清24份，羊陽性血清43份、陰性血清33份；C試劑盒檢出牛陽性血清59份、陰性血清31份，羊陽性血清40份、陰性血清36份；D試劑盒檢出牛陽性血清62份、陰性血清28份，羊陽性血清45份、陰性血清31份。結果見表2、表3。

表2 牛布魯菌病cELISA試劑盒檢測結果

序號英國cELISA試劑盒A試劑盒B試劑盒C試劑盒D試劑盒1-51+++++52-73-----74-81-++++82-84-++--85-86-++-+87-88-+---89+++-+90--+--

表3 羊布魯菌病cELISA試劑盒檢測結果

序號英國cELISA試劑盒A試劑盒 B試劑盒C試劑盒D試劑盒1-38+++++39-65-----66-69-+---70-72+++-+73-+--+74++-++75-++++76-++-+

2.2 檢測結果差異性分析

2.2.1 牛血清

應用A、B、C、D 4種試劑盒對已確診的90份牛血清進行檢測。根據檢測結果可知，4種試劑盒敏感性均為100%(52/52)；特異性介于60.53%～81.58%之間，其中C試劑盒特異性最高為81.58%(31/38)，A試劑盒特異性最低為60.53%(23/38)；與英國參考實驗室APHA競爭性ELISA試劑盒檢測完全符合的為C試劑盒，Kappa值為0.84；A、B、D試劑盒均為高度符合。具體結果見表4。

表4 4種不同廠家cELISA檢測試劑盒敏感性和特異性結果比較-牛血清

樣品總數試劑盒檢測結果英國cELISA陽性陰性敏感性Sc/%特異性Sq/%假陽性率/%假陰性率/%與英國cELISA間的Kappa值90ABCD陽性5215陰性023陽性5214陰性024陽性527陰性031陽性5210陰性02810060.5339.4700.6410063.1636.8400.7410081.5818.4200.8410073.6826.3200.76

2.2.2 羊血清

應用A、B、C、D 4種試劑盒對已確診的76份羊血清進行檢測。根據檢測結果可知，A、B、D試劑盒的敏感性均為100%(42/42)，C試劑盒敏感性為95.24%(40/42)；特異性C試劑盒最高為100%(34/34)，A試劑盒最低為79.41%(27/34)；4種試劑盒與英國參考實驗室APHA競爭性ELISA試劑盒檢測Kappa值均在0.8以上，提示完全符合。具體結果見表5。

表5 4種不同廠家cELISA檢測試劑盒敏感性和特異性結果比較-羊血清

樣品總數試劑盒檢測結果英國cELISA陽性陰性敏感性Sc/%特異性Sq/%假陽性率/%假陰性率/%與英國cELISA間的Kappa值76ABCD陽性427陰性027陽性421陰性033陽性400陰性234陽性423陰性03110079.4120.5900.8110097.062.9400.9795.2410004.760.9510091.188.8200.92

3 討論

當前，我國布病采取以“檢疫撲殺和疫苗免疫”相結合的綜合防控措施，布病的準確檢疫和快速診斷是預防和控制布病的關鍵環(huán)節(jié)。cELISA方法是基于高特異性單克隆抗體的ELISA診斷方法，特異性單抗的運用，可消除部分由細菌交叉反應引起的非特異性反應，還可排除絕大多數牛種布魯菌19株免疫接種產生的殘留抗體的反應，操作簡便、快速、特異性好、準確度高[7-8]，常應用于布病的確診檢測。

通過檢測發(fā)現選擇的4個廠家市售的布病cELISA抗體檢測試劑盒，檢測同一批樣品結果存在差異。檢測牛血清，4個試劑盒敏感性一致均為100%，但C試劑盒特異性最高，且與英國參考實驗室APHA競爭性ELISA試劑盒檢測完全符合；檢測羊血清，C試劑盒敏感性為95.24%，但其特異性最高達100%，與英國參考實驗室APHA競爭性ELISA試劑盒檢測完全符合。同一廠家試劑盒檢測牛、羊血清結果也有差異，C試劑盒無論檢測?；蜓蜓逄禺愋远甲罡?，敏感性也較好；A試劑盒檢測?；蜓蜓逄禺愋远甲畹?；D試劑盒檢測牛血清特異性較B試劑盒好，但檢測羊血清特異性不及B試劑盒。

綜上所述，本研究選擇的4個國產布病cELISA抗體檢測試劑盒與英國參考實驗室使用的cELISA抗體檢測試劑盒相比符合度均較好，敏感性均很高，但特異性參差不齊，最高達100%，最低僅60.53%，特異性低會造成布病的誤判，引起不必要的經濟損失。此次研究還發(fā)現選擇的4個試劑盒檢測羊血清的特異性均顯著高于檢測牛血清的特異性，可能與ELISA試劑盒包被的抗原特異性有關，具體原因還需進一步研究。