姚志浩，梅文晴，馮宇妍，倪迎冬

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開放試驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

B族維生素是水溶性維生素，包括B1、B2、煙酸、泛酸、B6、B12等，是維持細(xì)胞正常生理功能和特定代謝反應(yīng)所必需的微量低分子有機(jī)化合物。一般來說，B族維生素在大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)是不能合成，必須通過飲食的攝入獲得。而反芻動(dòng)物瘤胃中合成的B族維生素可以滿足其營(yíng)養(yǎng)需求，即使日糧中不含B族維生素，只要瘤胃功能正常，瘤胃微生物合成的B族維生素也足以避免缺乏癥的發(fā)生[1]。然而，近年來的研究表明，在奶牛中添加VB3和膽堿可以提高奶牛的產(chǎn)奶量和乳脂率，日糧中添加VB1可以增加或傾向于增加牛奶和成分的產(chǎn)量[2-4]。從而提示：在瘤胃中合成的B族維生素不能滿足反芻動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需求。特別是幼年反芻動(dòng)物，因其瘤胃尚未完全形成一個(gè)完整的微生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)粗飼料的利用率較低，更需要在日糧中補(bǔ)充一定量的維生素B[5]。

哺乳動(dòng)物的腸道內(nèi)寄居著數(shù)萬(wàn)億微生物，統(tǒng)稱為微生物群落。腸道菌群的穩(wěn)態(tài)決定其黏膜屏障的完整性與機(jī)體健康，而腸道的發(fā)育及其功能對(duì)動(dòng)物的健康和生長(zhǎng)具有重要作用，如何促進(jìn)腸道的發(fā)育完善便成為了提高生產(chǎn)性能的關(guān)鍵因素[6]。研究表明，維生素B12可以調(diào)節(jié)酶的活性，阻止腸桿菌科細(xì)菌的快速生長(zhǎng)，而且B族維生素補(bǔ)充劑可能對(duì)腸道疾病有一定的預(yù)防作用[7-8]。

目前，有關(guān)日糧中補(bǔ)充復(fù)合維生素B對(duì)生長(zhǎng)期山羊生長(zhǎng)性能的研究較少，最佳添加劑量尚未見報(bào)道。有關(guān)復(fù)合維生素B對(duì)山羊腸道菌群組成的影響研究亦未見報(bào)道，而腸道菌群對(duì)黏膜屏障的完整性及生長(zhǎng)性能都具有重要作用。因此，本研究旨在探討添加不同濃度的復(fù)合維生素B對(duì)生長(zhǎng)性能和腸道微生物菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與日糧

選取20只3-4月齡(16.78±1.52)kg的波雜雌山羊作為試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)開始前預(yù)飼2周，試驗(yàn)期為56 d，精飼料和粗飼料的比例為40∶60，中劑量復(fù)合維生素B的補(bǔ)充濃度參考之前研究中的飼料配方中的添加劑量[9]。復(fù)合維生素B(河北某獸藥業(yè)有限公司)包括維生素B1、B2、B6、B12、B3和B5。在精料(南京青龍山飼料營(yíng)銷部)中分別添加0 mg/kg復(fù)合維生素B(對(duì)照組，C)；低劑量復(fù)合維生素B，含1.2 mg/kg維生素B1、2.4 mg/kg維生素B2、2.4 mg /kg維生素B3、2.4 mg /kg維生素B5、1.2 mg/kg維生素B6、8 μg/kg維生素B12(低劑量組，L)；中劑量復(fù)合維生素B，維生素B添加劑量為低劑量組的5倍(中劑量組，M)；高劑量復(fù)合維生素B，維生素B添加劑量為低劑量組的10倍(高劑量組，H)。日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。在試驗(yàn)期間，自由采食飲水，每日于8：00和16:00時(shí)飼喂。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

原料營(yíng)養(yǎng)水平精粗比40∶60凈能量/(MJ·kg-1)8.23苜蓿青貯/%60粗蛋白/%3.84玉米/%22.4粗脂肪/%1.09麩皮/%4.8中性洗滌纖維/%34.94豆粕/%10.8酸性洗滌纖維/%24.59小蘇打/%0.4鈣/%0.90預(yù)混料/%1.6磷/%0.33總計(jì)100

注:預(yù)混料是由同一類的多種添加劑或不同類的多種添加劑按一定配比制作而成的勻質(zhì)混和物，每千克預(yù)混料為日糧提供：VA 110 kIU, VD 65 kIU, VE 320 IU, 銅 460 mg, 鐵 1 900 mg, 鋅 1 800 mg, 錳 1 600 mg, 碘 30 mg, 鈷 15 mg, 錫 6 mg,食鹽 160 g;營(yíng)養(yǎng)水平是指日糧中營(yíng)養(yǎng)成分的含量,本試驗(yàn)中均為計(jì)算值。

1.2 樣品采集

分別于試驗(yàn)前(0 d)、試驗(yàn)后第28天和56天稱重(禁食一夜)，記錄每日采食量。由于低劑量組較對(duì)照組無明顯變化，且VB添加量較低，因此僅對(duì)對(duì)照組、中劑量組和高劑量組進(jìn)行樣品采集及相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。采集頸靜脈血液并制成血漿備測(cè)。4 ℃，3 500 r/min離心15min，將分離的血漿放于EP管中儲(chǔ)存在-20 ℃和-80 ℃冰箱內(nèi)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集新鮮糞便，置于液氮中保存，用于16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序。

1.3 糞便16S rRNA基因擴(kuò)增子焦磷酸測(cè)序

采用CTAB或SDS方法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取。進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物的混樣和純化，使用Ion S5TMXL進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。將得到的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)進(jìn)行拼接過濾得到最終的有效數(shù)據(jù)(Clean Reads)。利用Uparse軟件對(duì)所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)，對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析，獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平：kingdom(界)，phylum(門)，class(綱)，order(目)，family(科)，genus(屬)，species(種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用MUSCLE軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

1.4 血液生化指標(biāo)檢測(cè)

血漿總膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、甘油三酯(TG)和葡萄糖(GLU)使用全自動(dòng)生化分析儀(7020，日立，東京，日本)測(cè)量。

1.5 血漿維生素B濃度的測(cè)定

血漿中維生素含量采用山羊維生素B酶聯(lián)免疫分析試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。血漿中VB1和VB2的含量采用HPLC方法(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Mean±SEM表示。采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，將P<0.05視為差異顯著，P<0.01視為差異極顯著。對(duì)于C、M和H組的物種豐度和ACE指數(shù)等，用其相對(duì)豐度與飼料中復(fù)合維生素B的劑量進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量復(fù)合維生素B對(duì)山羊體重、采食量和料重比的影響

從表2中可以看出，在試驗(yàn)期間各組山羊體重?zé)o顯著變化(P>0.05)。與C組相比，H組增重在第56天顯著升高(P<0.05)，但L和M組無顯著變化(P>0.05)；在試驗(yàn)第56天時(shí)H組的料重比顯著低于C組(P<0.05)，但與L和M組相比，C組無顯著變化(P>0.05)。由圖1可知，在試驗(yàn)期間各組山羊的采食量無顯著變化(P<0.05)。

表2 復(fù)合維生素B對(duì)山羊體重、增重和料重比的影響

項(xiàng)目C組L組M組H組第1天體重/kg17.56±0.4016.02±0.4316.78±0.8716.76±0.90第28天體重/kg20.76±0.3419.08±0.5820.26±1.0320.34±0.87第56天體重/kg23.76±0.2722.26±0.4423.28±0.9223.42±0.94總增重/kg6.20±0.13b6.24±0.17ab6.50±0.09ab6.66±0.11a料重比13.14±0.29a12.87±0.30ab12.49±0.15ab12.20±0.15b

注：相同指標(biāo)不同組別比較，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同

圖1 復(fù)合維生素B對(duì)山羊采食量的影響

2.2 復(fù)合維生素B對(duì)山羊血液生化指標(biāo)的影響

從表3可知，H組血漿中總蛋白和球蛋白水平較C組明顯降低(P<0.01)，而山羊白蛋白濃度無變化(P>0.05)。同時(shí)，與C組相比，H組山羊血漿總膽固醇水平明顯降低(P<0.05)。M組血漿中各種血液生化指標(biāo)相比C組均無顯著變化(P>0.05)。

2.3 復(fù)合維生素B對(duì)山羊血漿維生素B含量的影響

由圖2a和2b可知，與對(duì)照組相比，H組血漿VB1和VB2的含量略有升高但無顯著差異(P>0.05)。從圖2c可以看出，H和M組血漿維生素B的濃度相比對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。

2.4 復(fù)合維生素B對(duì)山羊糞便中微生物多樣性的影響

通過對(duì)山羊糞便中細(xì)菌16S rRNA基因的焦磷酸測(cè)序分析，得到H、M和C組OTU的序列數(shù)分別為83321、84469和85798個(gè)。從圖3A和3B中可以看出，隨著測(cè)序深度的增加，復(fù)合維生素B的添加劑量越高則物種的豐度越低。從表4中可以看出在C、M和H組的物種豐度及ACE指數(shù)中，H組顯著高于C組，且物種豐度和ACE指數(shù)與復(fù)合維生素B的濃度呈負(fù)相關(guān)。

表3 復(fù)合維生素B對(duì)山羊血液生化指標(biāo)的影響

參數(shù) C組M組H組總蛋白/(g·L-1)84.74±3.09a78.02±0.64ab73.50±3.33b白蛋白/(g·L-1)22.98±1.3824.14±0.6024.82±0.51球蛋白/(g·L-1)61.76±3.94a54.28±0.84ab48.68±3.49b總膽固醇/(mmol·L-1)1.53±0.04a1.47±0.05ab1.34±0.06b甘油三酯/(mmol·L-1)0.18±0.0250.23±0.0380.23±0.037乳酸脫氫酶/(U·L-1)279.20±17.21275.20±13.90299.60±20.04葡萄糖/(mmol·L-1)3.15±0.193.45±0.043.53±0.11高密度脂蛋白膽固醇/(mmol·L-1)0.95±0.081.03±0.060.91±0.02低密度脂蛋白膽固醇/(mmol·L-1)0.43±0.030.51±0.030.44±0.07

注：*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)

圖2 復(fù)合維生素B對(duì)山羊血漿中VB1(a)、VB2(b)和總VB(c)含量的影響

注：稀釋曲線中，橫坐標(biāo)為從某個(gè)樣本中隨機(jī)抽取的測(cè)序條數(shù)，縱坐標(biāo)為基于該測(cè)序條數(shù)能構(gòu)建的OTU數(shù)量，用來反映測(cè)序深度情況，不同的樣本使用不同顏色的曲線表示；等級(jí)聚類曲線中，橫坐標(biāo)為按OTUs豐度排序的序號(hào)，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)的OTUs的相對(duì)豐度，不同的樣本使用不同的顏色的折線表示。

圖3 C、M和H組稀釋曲線(A)和等級(jí)聚類曲線(B)的比較

表4 糞便微生物α多樣性比較

參數(shù)C組M組H組相關(guān)系數(shù)r物種數(shù)1 475.00±3.00a1 433.67±9.52ab1 387.00±27.07b-0.999*Simpson指數(shù)0.993±0.000.990±0.000.991±0.00-0.655Chao1指數(shù)1 734.02±187.081 506.72±11.901 448.60±24.33-0.946ACE指數(shù)1 586.27±41.52a1 507.61±10.25ab1 448.81±28.25b-0.997#覆蓋度1.00±0.001.00±0.001.00±0.00PD whole tree81.15±1.6079.57±1.0179.76±2.26-0.806

注：r為微生物相對(duì)豐度與復(fù)合維生素B劑量之間的相關(guān)系數(shù)；*表示顯著相關(guān)(P<0.05)，#表示有變化趨勢(shì)(0.05

2.4 山羊糞便微生物的門水平和種水平的微生物組成

由圖4可知，擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)在三組中均為優(yōu)勢(shì)菌門，但三組中各優(yōu)勢(shì)菌門均無顯著差異(P>0.05)。在種水平上，由表5可知，共有4個(gè)菌種在種水平上發(fā)生顯著變化，其中普雷沃氏菌(Prevotellacopri)和多型擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)在H組顯著高于C組(P<0.05)。而M和H組瘤胃球菌(Ruminococcusbromii)和大腸桿菌(Escherichiacoli)的相對(duì)豐度均顯著低于C組(P<0.05)。

圖4 復(fù)合維生素B對(duì)山羊單個(gè)樣本(A)和組間(B)門水平菌群組成的影響

表5 組間差異顯著的微生物相對(duì)豐度 %

2.5 糞便菌群組間物種分析t檢驗(yàn)

從圖5A和5B可以看出，M和H組腸桿菌目的豐度顯著低于C組 (P<0.05)。同時(shí)，在圖5C和5D中，M和H組腸桿菌科的水平也較C組顯著下降(P<0.05)。M組的瘤胃球菌科水平也顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。由圖5E可知，H組與C組相比，腸桿菌屬和產(chǎn)氫厭氧桿菌屬的相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05)。而圖5F中腸桿菌屬的相對(duì)豐度中，M組顯著低于C組(P<0.01)。由圖5G和5H可知，H和M組大腸桿菌的豐度相比對(duì)照組顯著降低 (P<0.05)。此外，H組的螺旋體的相對(duì)豐度較C組也顯著降低(P<0.01)。

圖5 糞便菌群目(A,B)、科(C,D)、屬(E,F)和種(G,H)水平組間物種分析t檢驗(yàn)

3 討論

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)微生物合成的B族維生素可以滿足機(jī)體的需要，但由于幼齡反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育不完全以及近年來人們對(duì)反芻動(dòng)物產(chǎn)品的要求越來越高，飼糧中補(bǔ)充維生素B用量的研究也越來越多[10-11]。但迄今為止山羊日糧中復(fù)合維生素B的適宜添加劑量尚未見報(bào)道[12]。在本試驗(yàn)中，隨著復(fù)合維生素B添加劑量增加，山羊增重也隨之增加。同時(shí)，有研究表明，在犢牛日糧中補(bǔ)充維生素B對(duì)其采食量沒有顯著影響[13]，這和本研究結(jié)果一致。除此之外，在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著日糧中復(fù)合維生素B添加劑量的提高，山羊的料重比顯著降低，這說明日糧添加維生素B可能對(duì)飼料的利用率具有積極作用。

機(jī)體是一個(gè)大的穩(wěn)態(tài)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生生理或病理變化時(shí)，必定伴隨著血液成分的改變。因此，血液指標(biāo)的檢測(cè)在臨床上具有重要意義。有研究表明維生素B2可以促進(jìn)膽固醇的代謝[14]，本試驗(yàn)中血漿膽固醇含量的變化可能與此相關(guān)，說明補(bǔ)充維生素B可能對(duì)機(jī)體的代謝具有積極作用。此外，日糧添加維生素B復(fù)合物后，血漿總蛋白和球蛋白水平顯著下降，這和其他動(dòng)物上的結(jié)果是一致的[15]，提示血漿中總蛋白和球蛋白的含量可能作為補(bǔ)充維生素B的血漿標(biāo)記物之一。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，飼喂復(fù)合維生素B會(huì)使山羊血漿中維生素B的含量顯著提高，說明山羊可以吸收日糧中添加的維生素B，以滿足機(jī)體的需求，并不會(huì)隨尿液和糞便完全排出體外。

有研究表明，補(bǔ)充維生素B會(huì)影響腸道微生物組成[16]，這與本試驗(yàn)結(jié)果是基本一致的。在本試驗(yàn)中隨著維生素B濃度的增加，糞便微生物的物種豐度和ACE指數(shù)明顯下降，且與復(fù)合維生素B的濃度梯度呈負(fù)相關(guān)，說明反芻動(dòng)物飼糧中添加維生素B會(huì)降低腸道微生物的相對(duì)豐度，雖然腸道菌群的豐富度是腸道健康的標(biāo)志之一，但在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)腸道菌群豐度的降低主要體現(xiàn)在腸桿菌目水平的降低，其他菌群的豐度變化主要體現(xiàn)在屬和種水平，對(duì)腸道菌群豐度的影響較小，而有報(bào)道指出，在腸道中腸桿菌是合成核黃素的主要菌群[17]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著復(fù)合維生素B的補(bǔ)充劑量的增高，糞便中H和M組的腸桿菌的豐度和對(duì)照組相比在不同水平均顯著降低。所以，腸道微生物豐度的降低，可能是由于日糧補(bǔ)充了足夠量的核黃素引起的。一些不太常見的細(xì)菌，例如誘導(dǎo)纖維吸收和淀粉降解的普雷沃氏菌，其相對(duì)豐度也會(huì)在補(bǔ)充維生素B后顯著升高[18]。本試驗(yàn)中H組糞便中的普雷沃氏菌的相對(duì)豐度相對(duì)C組顯著升高。還有研究表明，人類腸道中編碼大量碳水化合物降解活動(dòng)的多型擬桿菌，其具有在飲食衍生碳水化合物和宿主衍生碳水化合物之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換的能力[19]。擬桿菌也存在有害的一面，當(dāng)腸道正常的微生態(tài)平衡被打破時(shí)，可引發(fā)內(nèi)源性感染，因此，多形擬桿菌是否是有益菌，尚存在爭(zhēng)議。本試驗(yàn)中H組糞便中其相對(duì)豐度相比C組也是顯著增加的，這些菌群的增加可能和山羊飼料轉(zhuǎn)化率有密切的聯(lián)系。與此同時(shí)，硫酸鹽還原菌如梭狀芽孢桿菌科、腸桿菌科、擬桿菌科等與結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[20-22]，本研究發(fā)現(xiàn)這幾種菌的相對(duì)豐度在飼喂復(fù)合維生素B后均顯著降低。綜上所述，在山羊日糧中補(bǔ)充復(fù)合維生素B會(huì)顯著改善山羊的生長(zhǎng)性能，這些變化可能和腸道中菌群的變化有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究表明，在生長(zhǎng)期山羊日糧中添加復(fù)合維生素B在提高其增重的同時(shí)可以降低料重比，且在本試驗(yàn)中高劑量組復(fù)合維生素B的效果最佳，這可能與普雷沃氏菌等有益菌豐度的增加而有害菌豐度減少有關(guān)，其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的探討。