付言峰，王學敏，王麗，李悅，方曉敏，任守文

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所/農(nóng)業(yè)部種養(yǎng)結合重點實驗室/江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺,江蘇 南京 210014)

產(chǎn)仔數(shù)是養(yǎng)豬生產(chǎn)中一個重要的繁殖性狀和經(jīng)濟性狀，產(chǎn)仔數(shù)受排卵率、受精率、胚胎存活率和子宮容量等一系列因素的影響，其中胚胎存活率直接反映潛在產(chǎn)仔數(shù)的多少[1-3]。停育吸收的胚胎一般認定為胚胎死亡，胚胎死亡一個關鍵時期為胚胎附植期[4-7]，而這些胚胎的死亡是導致產(chǎn)仔數(shù)下降的一個重要原因[3,6-7]。此外，豬作為一個良好的動物模型，在研究人類附植障礙疾病(如流產(chǎn))的過程中也發(fā)揮著重要的作用[8]。因此，研究豬胚胎附植的調(diào)控機制意義重大。

豬胚胎附植的調(diào)控機制目前還不清楚，現(xiàn)已報道一些趨化因子、大分子、蛋白在附植調(diào)控中發(fā)揮作用[9-10]，例如趨化因子受體- 1 (CXCR-1)[11]、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子類基因1(retrotransposon like 1, RTL 1)[12]、促紅細胞生成素產(chǎn)生肝細胞受體-配體(eph-ephrin) 系統(tǒng)[13]和瘦素基因(leptin or LEP)[14]等。在這些基因中，ephrin A1是Eph-ephrin系統(tǒng)中一對重要的配體基因，此系統(tǒng)通過細胞間通訊在多種發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，包括細胞遷移、黏附、血管發(fā)生和神經(jīng)元可塑性[15-16]。有研究報道，ephrin A1的mRNA和蛋白在胚胎附植期的人[17-19]、小鼠[20]和豬[13]的子宮內(nèi)膜和胚胎中均有較高表達。

鑒于ephrinA1基因在豬繁殖過程中的生物學功能，本研究采用Real-time定量PCR(qPCR)和Western blot方法分析了ephrinA1基因在胚胎附植過程中母豬繁殖組織樣品中的表達，并分析了其在不同組織間和不同繁殖力母豬之間是否存在差異，且將這些表達差異與繁殖表觀性狀進行了關聯(lián)分析。研究結果將有助于人們對進一步了解ephrin A1在胚胎附植后期調(diào)控中的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選用24頭妊娠第22天的長大二元后備母豬(頭胎)，平均體重為(133.76±3.52)kg。將試驗豬根據(jù)體重平分為2組，分別注射7.5 mL和5 mL PG600，人工授精方式配種，制備不同胚胎數(shù)豬，這些豬的飼養(yǎng)條件和環(huán)境保持一致。妊娠第24天的豬選用5頭本團隊自主培育的有完全自己知識產(chǎn)權的國家新品種-蘇山豬(第5胎次)，全部采用本交方式配種，這些豬的飼養(yǎng)條件和環(huán)境保持一致，配種后統(tǒng)一管理。至妊娠日齡后，均按照本單位規(guī)定的實驗動物福利與倫理規(guī)定進行屠宰，屠宰后立即采集卵巢黃體、子宮內(nèi)膜附植點、尿囊絨毛膜、胚胎、子宮內(nèi)膜附植點間、子宮體和子宮頸等繁殖組織樣品，液氮保存。

1.2 引物設計

豬ephrin A1(又名EFNA1，GenBank: NM_001123110.1)的Real-time qPCR引物均由Primer Premier 5.0軟件設計，引物由ThermoFisher 生物公司合成 (表1)。所有的引物均經(jīng)過預實驗優(yōu)化，PCR擴增效率均在94%～102%之間。GAPDH為持家基因。

表1 豬ephrinA1基因?qū)崟r熒光定量PCR分析用引物序列及反應條件

基因名稱引物序列(5'→3')退火溫度/℃PCR產(chǎn)物長度/bpephrin A1GCAAGGAGTTCAAAGAGGGAC58.8117GAGGACTGTGGGTGATTTTGC59.5CACGACTTCAGGCATATCCC57.7GAPDHCCTGGAGAAACCTGCAAAATA57.4100AACCTGGTCCTCAGTGTAGCC58.2

1.3 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及Real-time qPCR

總RNA采用TRIzol/氯仿方法[21-22]從豬組織樣品中提取，之后用檢測提取的RNA濃度，再用分光光度計(NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer, USA)和1.5%的瓊脂糖電泳檢測RNA完整性?？俁NA反轉(zhuǎn)錄成cDNA是根據(jù)First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo, USA)使用說明書進行操作。為減少干擾，每個cDNA樣本都稀釋10倍(5 μL cDNA + 45 μL H2O)，每個樣品做3個重復，并用ddH2O代替cDNA模板做陰性對照，以檢測是否有外源DNA污染[23]。

Real-time qPCR以上述cDNA為模板，利用SYBR Green RT-qPCR 試劑盒(ThermoFisher, USA)20 μL PCR反應體系上機(7900HT Fast Real-Time PCR System)試驗。反應體系如下：SybrGreen qPCR Master Mix (2×) 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板(cDNA稀釋10倍)1 μL, Taq DNA Polymerase 0.3 μL, 加Rnase-free ddH2O到 20 μL。反應程序如下：95℃ 5 min 熱啟動HotStarTaq酶活性；95 ℃熔解20 s，60 ℃退火25 s ，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次；45～95 ℃，讀板時0.1 ℃/s 進行溶解曲線分析。GAPDH為持家基因，隨機選取部分組織樣，用β-actin作第二持家基因進行驗證。

1.4 蛋白提取及免疫印跡

蛋白提取使用自配的蛋白裂解液，實驗步驟按順序為：SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色(Invitrogen, USA)和化學發(fā)光檢測試劑盒(Sunbio, 中國)曝光。蛋白提取和實驗方法如文獻[24]報道。免疫印跡實驗所用一抗為稀釋1 000倍的鼠抗人抗體(mouse anti-human ephrin A1 mAb, sc-377362, Santa Cruz, USA) ，二抗為：稀釋2 000倍的羊抗鼠抗體，辣根過氧化物酶標記(南京凱基生物)。最后使用LabWorks灰度圖像軟件分析免疫印跡的電泳條帶。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

基因表達量和繁殖性狀之間的關聯(lián)分析使用SPSS 22.0的“Spearman相關”程序評估；實時熒光定量PCR的數(shù)據(jù)利用2-ΔΔCt法分析，得到ephrin A1的mRNA 相對表達量，內(nèi)參基因為GAPDH[25-26]；不同組織間mRNA和蛋白表達量的差異性顯著水平通過SAS 8.2統(tǒng)計軟件包進行GLM分析，結果以最小二乘均值±標準誤(LSmeans±SE)表示。

2 結果與分析

2.1 不同繁殖力母豬的制備效果

利用7.5 mL和5 mL PG600注射誘導生產(chǎn)高胚豬和低胚豬，兩組母豬平均體重分別為132.0 kg和135.3 kg，注射后發(fā)情間隔分別為4 d和3.8 d，均差異不顯著。高胚豬相較于低胚豬，黃體數(shù)、總胚胎數(shù)和正常胚胎數(shù)均顯著增加 (P<0.05)，總胚胎數(shù)/黃體數(shù)極顯著下降(P<0.05)。另外，高胚胎豬的胚胎大小(包括平均胚胎重量和胚胎長度)和卵巢大小(包括平均卵巢重量和卵巢面積)小于低胚胎豬，沒有顯著差異(圖1)。

2.2 ephrin A1在附植后期豬繁殖組織的mRNA表達

Real-time qPCR結果表明：妊娠第22天，豬子宮內(nèi)膜附植點的ephrin A1表達量顯著高于尿囊絨毛膜和胚胎(P<0.05)。其中在子宮內(nèi)膜附植點處，ephrin A1的mRNA表達在高/低胚胎豬間差異不顯著；尿囊絨毛膜處，ephrin A1的mRNA表達在高/低胚胎豬間差異亦不顯著；但在胚胎處，ephrin A1在高胚豬胚胎中的mRNA表達量顯著小于低胚豬(P<0.05)。另外，妊娠豬中ephrin A1的mRNA表達量顯著高于空懷豬(P<0.05)(表2)。

妊娠第24天，ephrin A1的mRNA在5種繁殖組織中的表達量差異顯著，其中在妊娠豬(3頭)子宮內(nèi)膜附植點的表達量最高(P<0.05)，其次按高到低依次是子宮內(nèi)膜附植點間、子宮頸、卵巢黃體和胚胎，表達趨勢與妊娠第22天的基本一致。另外，妊娠豬中ephrin A1的mRNA表達量顯著高于空懷豬(2頭)(P<0.05)(圖2)。

2.3 ephrin A1在附植后期母豬繁殖組織的蛋白表達

免疫印跡結果表明：在胚胎附植后期的妊娠第24天，ephrin A1蛋白在豬子宮內(nèi)膜附植點處均有較強表達，其次為子宮內(nèi)膜附植點間，蛋白表達量最低的卵巢黃體(圖3)。ephrin A1蛋白表達曲線與mRNA表達趨勢基本一致，表明豬子宮內(nèi)膜附植點可能是ephrinA1基因的主要靶組織，ephrin A1主要通過這個靶組織參與胚胎附植調(diào)控。

2.4 ephrin A1基因mRNA表達水平與繁殖性狀間的關聯(lián)分析

關聯(lián)分析結果表明，ephrin A1 mRNA表達與胚胎長度呈正相關，相關系數(shù)為0.49。 相反，ephrin A1的mRNA表達與總胚胎數(shù)(或正常胚胎數(shù))之間存在負相關，相關系數(shù)為-0.25。其中，相較于胚胎重、正常胚胎數(shù)和卵巢重，ephrin A1表達和胚胎長之間的相關系數(shù)最高，與總胚胎數(shù)之間的相關系數(shù)最低(表3)。

*表示組間比較，差異顯著(P<0.05)

表2 妊娠第22天高胚豬和低胚豬繁殖組織樣品中的ephrin A1的mRNA表達變化(平均數(shù)±標準誤)

組織樣品nephrin A1高胚豬低胚豬空懷豬T檢驗(高胚和低胚間比較)子宮內(nèi)膜附植點54.20±1.34 a6.18±1.45 a 0.14±0.02不顯著尿囊絨毛膜53.01±1.34 a3.89±1.44 b不顯著胚胎50.72±0.22b4.65±1.81 a P<0.05

注：不同組織樣品間小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，空懷豬采集的組織樣為子宮內(nèi)膜

圖2 妊娠第24天ephrin A1在豬繁殖組織的相對mRNA表達量

圖3 妊娠第22天母豬子宮內(nèi)膜附植點、附植點間和卵巢黃體組織樣品中ephrin A1的蛋白表達量

針對每頭豬進行ephrin A1 mRNA表達量和繁殖性狀的線性圖分析，結果表明： ephrin A1 mRNA表達量在不同豬之間的表達差異不大，而繁殖性狀值在不同豬之間則差異明顯。進一步證明ephrin A1表達量和繁殖性狀間的變化有時一致(正相關，如3號豬)，有時不一致(負相關，如2號豬)。ephrinA1基因的表達量峰值和大多數(shù)繁殖性狀的最低值同時出現(xiàn)在1號豬；相反，ephrinA1基因的表達量最低值和大多數(shù)繁殖性狀的峰值同時出現(xiàn)在6號豬 ，這說明ephrinA1基因mRNA表達與繁殖性狀間的相關性在不同豬之間也有差異(圖4)。

表3ephrinA1基因mRNA表達與長大母豬繁殖性狀間的相關系數(shù)

基因胚胎重/g胚胎長/mm總胚胎數(shù)正常胚胎數(shù)卵巢重/gephrin A10.360.49-0.25-0.230.15

圖4ephrinA1基因在每頭豬繁殖組織中的mRNA表達與其繁殖性狀間的關聯(lián)分析

3 討論

豬胚胎在第18天和第24天之間完成胚胎附植[27-28]，胚胎附植中的胚胎數(shù)量和尺寸是影響產(chǎn)仔數(shù)和初生重要因素[13]。由于產(chǎn)仔性狀是伴性性狀，故用標記輔助選擇技術輔助選擇 (marker-assisted selection, MAS) 技術可以更有效地加快育種效率[29-30]。而MAS的應用需要我們挖掘更多的候選基因及其分子標記[31]。因此，本研究旨在確定高胚豬和低胚豬之間是否存在ephrinA1基因的表達變化，以及這些表達變化是否與胚胎性狀之間存在某些關聯(lián)。

高胚豬和低胚豬的制備試驗結果顯示，黃體數(shù)、正常胚胎數(shù)和總胚胎數(shù)均受PG600劑量的顯著影響，相比于1倍劑量，1.5倍的劑量會增加上述性狀值，這表明較高的PG600能誘導更多的排卵和更多的胚胎進行附植。55%的母豬在注射PG600后7 d內(nèi)誘導發(fā)情，且這些發(fā)情母豬中90%會正常排卵[32]。初情期大白豬母豬用PG600處理后，排卵率會顯著提高[33]。ephrin A1在高胚豬胚胎中的mRNA和蛋白表達顯著低于低胚豬，表明低ephrin A1表達對胚胎數(shù)量具有有利影響，這可能與Eph-ephrin系統(tǒng)的功能有關，有報道表明其在多種哺乳動物的胚胎附植期間細胞遷移和黏附過程中發(fā)揮排斥功能[16，34]。

基因表達結果表明妊娠豬ephrin A1的mRNA表達量顯著高于空懷豬，且豬早期妊娠的胚胎附植后期，ephrin A1的mRNA在子宮內(nèi)膜附植點的表達量最高，顯著高于子宮內(nèi)膜附植點間、尿囊絨毛膜、胚胎、子宮頸和卵巢黃體，說明子宮內(nèi)膜附植點可能是ephrin A1 mRNA表達的靶組織。周艷紅等[35]研究表明，ephrinA1基因在梅山豬妊娠第24天有較高表達量，高于妊娠第13天，但低于妊娠第18天；ephrin A1編碼區(qū)有5個cSNPs變異，其中2個導致氨基酸突變,分別為Glu29Asn和Trp33Arg，位于ephrin A1外顯子1和外顯子2上[35]。LIM等[16]研究表明，ephrin A1在妊娠第20天豬子宮內(nèi)膜的mRNA表達量高于妊娠第9、10、12、13天和空懷豬，但低于妊娠第 14天和第30天。有研究表明，胚胎附植期，ephrin A1 mRNA 在人胚泡中有強表達[34]。本研究Western blot結果顯示，妊娠第24天，ephrin A1蛋白在子宮內(nèi)膜附植點的表達量最高，其次為子宮內(nèi)膜附植點間和卵巢黃體，蛋白表達趨勢與mRNA表達趨勢一致，且這個表達差異排序與瘦素受體[36]、脂肪肥胖相關基因[23]等基因的表達規(guī)律類似。

基因表達與繁殖性狀之間的關聯(lián)結果表明，ephrin A1的mRNA表達與總胚胎數(shù)(或正常胚胎數(shù))之間呈負相關，與胚胎長度、重量呈正相關，由此作者推測這些基因的強烈表達可能不利于在附植后期提高胚胎數(shù)量，而有利于在此時期改善胚胎發(fā)育(長度和重量增加)。 FUJII等[34]報道，ephrin A1可以促進人Ishikawa細胞中的細胞間解離，這表明通過打開子宮內(nèi)膜上皮細胞屏障在胚胎附植的初始階段中起重要作用 。ephrin A1的沉默表達會降低豬子宮內(nèi)膜上皮細胞的遷移和黏附[22]。

綜上所述，高/低胚胎數(shù)母豬可以由PG600誘導生產(chǎn)，ephrin A1表達可能參與豬胚胎附植后期的基因調(diào)控，子宮內(nèi)膜附著位點可能是ephrin A1表達的靶組織，附植后期ephrin A1 mRNA表達與胚胎長度呈正相關，與胚胎數(shù)量呈負相關，這些會進一步影響胚胎發(fā)育。