田妮娜，劉興國(guó)，李 巖，王月玲

（蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州 730050）

兔眼刺激性試驗(yàn)（Draize 試驗(yàn)）是指動(dòng)物眼球接觸到化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的過(guò)程，是目前評(píng)估眼刺激性的金標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，通過(guò)實(shí)驗(yàn)人員肉眼觀察血紅蛋白的漏出和變性進(jìn)行評(píng)分，方法周期長(zhǎng)、成本高，存在一定的主觀性和差異性；同時(shí),隨著動(dòng)物保護(hù)運(yùn)動(dòng)的興起和人們對(duì)“3R”運(yùn)動(dòng)的關(guān)注[3],體外替代試驗(yàn)的研究已廣泛開(kāi)展[4-7]。

紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)（RBC）的基本原理是化學(xué)物質(zhì)損傷細(xì)胞膜，改變其滲透性，引起血紅蛋白的漏出和變性，進(jìn)而導(dǎo)致溶血發(fā)生[8]。含表面活性劑的產(chǎn)品主要通過(guò)破壞眼部脂質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)致?lián)p傷，這和紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)的基本原理類似[9]。故本研究收集易觸及眼睛的4類淋洗類化妝品（洗發(fā)、護(hù)發(fā)、沐浴和潔面），參照《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版)規(guī)定的眼刺激試驗(yàn)的要求，進(jìn)行紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)和Draize試驗(yàn)，并評(píng)價(jià)其相關(guān)性，以考察紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)淋洗類化妝品眼刺激性的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品一部分來(lái)自蘭州市藥品檢驗(yàn)所送檢的化妝品，其余部分市場(chǎng)購(gòu)買，洗發(fā)、護(hù)發(fā)、沐浴和潔面4類各20批次，配方中均含有表面活性劑。

1.2 2%紅細(xì)胞懸液（牛、羊、豬、兔）

購(gòu)自北京博爾西科技有限公司和岑溪鴻泉生物科技有限公司，100ml/瓶，2-8℃保存，3-4周內(nèi)使用。PBS（Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO40.24g，NaCl8g，KCl 0.2g,溶于1000ml純化水中，pH 為7.4，121℃滅菌30min），十二烷基硫酸鈉（SDS）（1000mg/L）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大耳白兔，普通級(jí)，雌雄兼用，雌性未孕，購(gòu)自蘭州畜牧獸醫(yī)研究所，并飼養(yǎng)在蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所藥理室普通級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：SCXK（甘）2015-0001號(hào)。

1.4 主要儀器

艾本德紫外分光光度計(jì)，艾本德高速離心機(jī)，IKA振蕩培養(yǎng)箱。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)

先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)預(yù)測(cè)樣品的HD50范圍。樣品用PBS配制成濃度為10000mg/L（w/v）的貯備液，超聲振蕩使其完全溶解。取不同濃度的樣品溶液 （逐級(jí)稀釋貯備液至 1000mg/L、100mg/L、10mg/L、1mg/L）、PBS（空白對(duì)照）、純化水（全溶血對(duì)照）、SDS（陽(yáng)性對(duì)照）各1.5mL，分別加入0.5mL羊紅細(xì)胞懸液，在32℃培養(yǎng)箱中振蕩孵育30min，13000r/min離心2min，取上清液，以PBS為空白對(duì)照，測(cè)定540nm、560nm、575nm波長(zhǎng)下的吸光度(A)。

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，預(yù)確定HD50的樣品濃度，為準(zhǔn)確的測(cè)定HD50值，在預(yù)測(cè)值上下均勻布置5個(gè)濃度，用PBS配制成濃度為2倍預(yù)測(cè)值的樣品貯備液，然后按照表1設(shè)計(jì)的方案進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 試驗(yàn)方案

用雙復(fù)管測(cè)定，取平均值，以A560縱坐標(biāo)，樣品濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)作線性回歸方程,計(jì)算HD50，血紅蛋白變性指數(shù)（DI）和HD50/DI，同時(shí)比較四種屬間實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。

1.5.2 家兔眼刺激試驗(yàn)

按《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007）對(duì)受試樣品進(jìn)行眼刺激性分級(jí)[9]。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)結(jié)果

80種化妝品體內(nèi)試驗(yàn)(兔眼刺激試驗(yàn))和四種紅細(xì)胞(牛/羊/豬/兔)溶血性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，見(jiàn)表2。

表2 80種化妝品體內(nèi)試驗(yàn)和四種紅細(xì)胞溶血性試驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。經(jīng)Kruskal-Wallis檢驗(yàn),在α=0.05的水平下，每類產(chǎn)品的動(dòng)物試驗(yàn)和四種溶血試驗(yàn)之間無(wú)顯著性差異 (P＞0.05)，但匯總80種化妝品后，P=0.01，存在一定差異，主要是兔紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)引起的差異。分析兔紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其HD50值均高于牛、羊、豬紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)的，DI值沒(méi)明顯區(qū)別，故導(dǎo)致HD50/DI值略高，產(chǎn)生差異。經(jīng)kappa一致性檢驗(yàn)，得出動(dòng)物試驗(yàn)和兔紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)一致性一般，牛、羊、豬紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)一致性良好。

3 討論

1)對(duì)受試物與紅細(xì)胞懸液作用的體積比進(jìn)行選擇，用不同體積比的純化水與綿羊紅細(xì)胞懸液混合，發(fā)現(xiàn)體積比為1∶3時(shí)，紅細(xì)胞發(fā)生全溶血。故選用體積比為 1∶3。

2)對(duì)測(cè)量波長(zhǎng)進(jìn)行選擇，采用不同濃度SDS，分別與羊紅細(xì)胞懸液作用，在540nm、560nm、575nm測(cè)定吸光度A，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制曲線，各波長(zhǎng)在100mg/L處吸光度達(dá)到最高峰（即紅細(xì)胞發(fā)生蛋白變性），在560nm波長(zhǎng)下最高峰后曲線接近直線，故選擇560nm為測(cè)量溶血波長(zhǎng)；540nm和575nm波長(zhǎng)下最高峰后曲線明顯下降，但在1000mg/L后，其曲線不再下降（即蛋白不在變性），故選擇1000mg/LSDS作為血紅蛋白變性的陽(yáng)性對(duì)照。

3)對(duì)北京博爾西科技有限公司和岑溪鴻泉生物科技有限公司的紅細(xì)胞懸液進(jìn)行比較研究，其制備方法、檢測(cè)報(bào)告參數(shù)、四種紅細(xì)胞懸液溶血試驗(yàn)結(jié)果基本相同，故市售的成品紅細(xì)胞懸液可以直接用來(lái)開(kāi)展溶血試驗(yàn)，但一定注意保存條件，且在效期內(nèi)使用。

4)本試驗(yàn)中，牛、羊、豬紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)和Draize試驗(yàn)之間無(wú)顯著性差異，研究表明，溶血試驗(yàn)適用于含表面活性劑的產(chǎn)品，洗發(fā)、護(hù)發(fā)、沐浴和潔面4類淋洗類產(chǎn)品均含有表面活性劑，因此，可以作為淋洗類化妝品眼刺激試驗(yàn)的一個(gè)初篩試驗(yàn)。同時(shí)，本研究收集4類化妝品中所用到的表面活性劑，覆蓋陰離子、陽(yáng)離子、兩性離子、非離子表面活性劑，刺激性涵蓋各個(gè)刺激反應(yīng)分級(jí)，溶血試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)相關(guān)性良好，進(jìn)一步證明紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)可用于評(píng)價(jià)淋洗類化妝品眼刺激性。

5)由于動(dòng)物種屬間紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)存在一定差異，牛、羊、豬紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)與兔紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)相比，更適合于淋洗類化妝品眼刺激試驗(yàn)的一個(gè)初篩試驗(yàn)。試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單快速，重復(fù)性良好,無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)于淋洗類化妝品眼刺激試驗(yàn)具有較好的眼刺激性預(yù)測(cè)能力，是一種有潛力的替代方法。