林德洪，陳 中，張 偉，胡 武，盧真保

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.廣州華芳煙用香精有限公司，廣東 廣州 510530)

金銀花(Honeysuckle)，正名為忍冬(品種來(lái)源：LonicerajaponicaThunb.)，如圖1?！敖疸y花”一詞在《蘇沈良方》中最早出現(xiàn)，且對(duì)其形狀特征進(jìn)行描述，其花初開(kāi)呈白色，其后變黃。其屬于忍冬屬植物初開(kāi)的花。在中藥領(lǐng)域，金銀花有重要的價(jià)值，也是藥食兩用的食材[1-3]。在我國(guó)，金銀花的種植區(qū)域集中在山東、陜西、河南、河北、湖北、江西、廣東等地。

圖1 金銀花

揮發(fā)油是存在于植物體中的一類(lèi)在常溫下可揮發(fā)的具有芳香氣味的油狀液體總稱(chēng)。在香料行業(yè)，把揮發(fā)油分成兩類(lèi)：精油和凈油。精油是指用水蒸氣蒸餾法、壓榨法、冷磨法、干餾法、超臨界萃取、分子蒸餾法從香原料植物器官(如花、葉、枝、籽等)中所制得的含香物質(zhì)的制品。凈油是指用有機(jī)溶劑萃取香料植物器官和其滲出物(樹(shù)脂、樹(shù)膠、香膏)，除去所用的溶劑而得到的香料制品[4]。金銀花香氣濃郁，是清幽型花香香韻，香氣豐富。其揮發(fā)油香韻豐富、特征鮮明。

有關(guān)金銀花的揮發(fā)油成分鑒定多采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)。如林凱[5]采用同時(shí)蒸餾萃取法提取福建金銀花揮發(fā)油，用GC-MS法分析鑒定；景延秋[6]等采用GC-MS法，研究了金銀花中揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分的種類(lèi)及含量；孫勝南[7]等用水對(duì)金銀花進(jìn)行提取，用大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離水提物，采用GC-MS法分析鑒定金銀花分離物，鑒定出38種成分。彭蓮[8]等應(yīng)用電子鼻技術(shù)與高效液相分析金銀花，研究金銀花氣味與化學(xué)成分之間的相關(guān)性。

二十一世紀(jì)以來(lái)，成分鑒定技術(shù)快速發(fā)展。氣相色譜-嗅覺(jué)測(cè)量法，簡(jiǎn)稱(chēng)GC-O法，嗅香師嗅聞從被測(cè)物分解出的成分的氣味，結(jié)合譜圖成分分析推斷、鑒別出相對(duì)應(yīng)的花合物，并對(duì)氣味特征進(jìn)行描述評(píng)價(jià)。GC-O可以鑒別出檢測(cè)物的具有獨(dú)特氣味的揮發(fā)性成分和不同濃度下各氣味成分對(duì)被測(cè)物整體香味的影響程度；在特征香味、香味活性化合物等成分鑒定方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。Lasekanetal.[9]使用GC-O技術(shù)的稀釋法，從多個(gè)蘋(píng)果品種鑒別出45個(gè)香氣活性物質(zhì)，使用多元統(tǒng)計(jì)分析PLS法得出10個(gè)關(guān)鍵香氣成分，關(guān)鍵成分主要為對(duì)傘花烴、苯甲酸甲酯、己酸甲酯以及乙酸乙酯等。Kraujalyteetal.[10]基于DF法對(duì)沙果果汁所含有的香氣活性成分進(jìn)行分析，分析鑒定出沙果香氣的主要貢獻(xiàn)物來(lái)自于己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸甲酯以及壬醛等。然而，金銀花揮發(fā)油活性香氣成分系統(tǒng)分析及加香評(píng)價(jià)應(yīng)用研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS結(jié)合GC-O技術(shù)，分析鑒定金銀花精油的特征香氣組分，建立金銀花精油香氣組分分析研究方法，探索其在煙草行業(yè)的應(yīng)用價(jià)值，旨在為金銀花在香料行業(yè)應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器設(shè)備

材料：金銀花為廣東省梅州市種植，采購(gòu)自廣州市清平藥材市場(chǎng)，見(jiàn)圖2。未加香加料煙絲葉組，廣東中煙工業(yè)公司提供。

試劑：石油醚(沸點(diǎn) 60～90℃)，廣州溶劑廠；乙醚(色譜純)，廣州溶劑廠；乙醇為分析純，蒸餾水。

儀器設(shè)備：流水式中藥粉碎機(jī)，溫州鼎歷醫(yī)療器械廠；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；加熱回流萃取裝置，廣州澤明儀器有限公司；HA-100-0.5型超臨界CO2萃取裝置，江蘇華安科研儀器有限公司；NVP-1000隔膜真空泵，CCA-1112A冷凍循環(huán)水機(jī)，N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會(huì)社；GC7890B-MS5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；ODP2嗅覺(jué)測(cè)量?jī)x，德國(guó)GERSTEL公司。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理

將無(wú)破損的金銀花放入烘箱，在50℃下烘5 h，再使用流水式粉碎機(jī)粉碎成粉末，并通過(guò)80目的篩網(wǎng)進(jìn)行篩分。

1.2.2 金銀花揮發(fā)油制備

石油醚萃取法。稱(chēng)取100 g金銀干花粉于2 L燒瓶?jī)?nèi)，按料液質(zhì)量比1∶12加入石油醚，在萃取時(shí)間3 h、萃取溫度45℃條件下浸提；過(guò)濾取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸干，得到金銀花凈油，稱(chēng)取質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值；記錄提油量。

超臨界CO2萃取法。取100 g金銀干花粉，應(yīng)用超臨界二氧化碳萃取設(shè)備，設(shè)定萃取壓力25 MPa，萃取溫度40℃，CO2流量為20 L/h，分離壓力6 MPa，分離溫度50℃。進(jìn)行超臨界萃取，收集分離釜的金銀花精油，稱(chēng)重。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均提油量。

1.2.3 卷煙加香感官評(píng)吸

按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，使用金銀花揮發(fā)油進(jìn)行加香實(shí)驗(yàn)，并運(yùn)用感官評(píng)價(jià)法對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。

設(shè)定好添加比例，將稱(chēng)量好的金銀花凈油和金銀花精油分別以70%乙醇稀釋?zhuān)謩e噴加于未加香加料的煙絲葉組上。將兩組煙葉分別卷成卷煙，放入恒溫恒濕箱中放置48 h以達(dá)到平衡。存放參數(shù)設(shè)置為：相對(duì)濕度(60±2)℃，溫度(22±1)℃；然后，進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.2.4 金銀花精油的成分檢測(cè)

對(duì)超臨界萃取法制備的金銀花精油進(jìn)行GC-MS和GC-O成分檢測(cè)。

1.2.4.1 金銀花精油GC-MS分析

色譜柱：HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱19091N-133i(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量：1 μL，分流比：50∶1；程序升溫：初溫40℃，保持1 min，然后以1℃/min升至150℃保持5 min，再以5℃/min到250℃保持10 min；載氣為高純He，流速1.0 mL/min；傳輸線(xiàn)溫度：260℃；四極桿溫度：150℃；EI電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍30～650 amu；溶劑不延遲。

1.2.4.2 金銀花精油GC-O分析

以乙醚為溶劑，按1∶3、1∶9、1∶27、1∶81、1∶243比例對(duì)金銀花精油進(jìn)行逐步梯度稀釋?zhuān)⒉捎肎C-O技術(shù)對(duì)金銀花精油溶液，進(jìn)行了稀釋嗅聞分析。

取稀釋液1 μL，注入嗅覺(jué)儀分析。一直到評(píng)價(jià)員在嗅辨器上無(wú)法嗅辨出香味，溶液稀釋停止。當(dāng)樣品中的香氣成分未被嗅辨出時(shí)，每種香氣活性物質(zhì)的香氣貢獻(xiàn)用所需的最小稀釋因子(稀釋因子)表示。每種香味成分的稀釋因子(FD)是對(duì)應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花揮發(fā)油卷煙加香評(píng)吸

2種方法提取的金銀花揮發(fā)油。金銀花凈油呈淺黃綠色，金銀花精油呈淡黃色，均澄清透明，無(wú)明顯刺激性，具有金銀花特有香味。金銀花精油具有自然清新的花香，清甜香較明顯，并伴有較輕青滋感、酸香；嗅聞香味較金銀花凈油的甜潤(rùn)感更足，清香突出。

通過(guò)感官評(píng)價(jià)，判定金銀花揮發(fā)油添加香煙評(píng)吸差別(見(jiàn)表1)。按照煙草行業(yè)評(píng)價(jià)規(guī)定，由煙草評(píng)吸小組，分別對(duì)添加了金銀花揮發(fā)油的卷煙樣品進(jìn)行盲評(píng)，記錄分值。

在卷煙中加入質(zhì)量比為0.001%和0.005%的金銀花揮發(fā)油，均表現(xiàn)出掩蓋煙草原有的香氣。添加0.001%揮發(fā)油，能增加卷煙香氣量，突出清甜花香；和空白對(duì)照煙比較，甜香、果香和藥草香有輕微增加；能有效掩蓋雜氣，提高煙氣豐富性；金銀花精油能諧調(diào)卷煙煙香，細(xì)膩飄逸煙氣。同種類(lèi)的金銀花揮發(fā)油樣品，添加低用量(0.001%)的評(píng)價(jià)總分高于添加高用量(0.005%)的樣品；添加比例較高的樣品有著較好的增香性、豐富性、清雅度；高比例條件下的金銀花精油，與卷煙的一致性和協(xié)調(diào)性更高。添加低比例的揮發(fā)油的樣品中，超臨界萃取的金銀花精油的評(píng)分最高。金銀花精油較凈油更好地提升了煙氣自然清新感、甜潤(rùn)感。2種金銀花揮發(fā)油，超臨界法金銀花精油更適合用于卷煙加香(見(jiàn)表1和表2)。

2.2 金銀花精油成分GC-MS分析

成分檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3和表3。從金銀花精油中共分離出68種化合物，主要由醇類(lèi)44.48%、烯類(lèi)16.49%、酸類(lèi)12.73%、醛類(lèi)7.88%、酯類(lèi)6.53%、酮類(lèi)4.10%等組成；它們的峰面積和共占金銀花精油成分總面積的92.21%；此外，還有少量微量化合物。在鑒定出的成分中，芳樟醇比例最高，占比是10.91%，其次是2-十三醇6.98%，1-二十二烯6.42%，二十九烯5.74%，棕櫚酸4.41%，羥基香茅醛4.30%等。

圖3 金銀花精油GC-MS總離子流色譜圖

表3 金銀花精油的揮發(fā)性成分

表3(續(xù))

表3(續(xù))

2.3 金銀花精油香氣成分GC-O鑒定

在金銀花精油揮發(fā)性成分中，通過(guò)嗅辨儀鑒定到香氣物質(zhì)57種(見(jiàn)表4)。金銀花精油整體香氣特征為清香、花香感較重，果香感也比較明顯，并伴有蜜甜香、輕微茴香和酸香。苯乙酸乙酯、苯乙醇、芳樟醇、羥基香茅醛、異戊酸香葉酯、苯甲醛、二氫芳樟醇、香蘭素、壬酸烯丙酯和氧化石竹烯的FD因子較大，都能達(dá)到81以上，說(shuō)明它們可以在濃度極低情況下散發(fā)出強(qiáng)烈的香氣，對(duì)金銀花精油香味影響較大。香氣強(qiáng)度最大的物質(zhì)有2種，分別為苯乙醇和羥基香茅醛，稀釋因子均為729，它們是對(duì)金銀花精油香味貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)。而且，這些組分的香味閾值都很低，苯乙醇的閾值低至0.004～0.007 mg/kg。閾值是指人們通過(guò)嗅覺(jué)能辨別某種香味時(shí)的最低嗅出濃度。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)香料的閾值越小，其香氣強(qiáng)度越大。這些組分的閾值低、稀釋因子大，也證明了它們是金銀花精油的重要香氣組分。

嗅香師經(jīng)過(guò)反復(fù)聞香，結(jié)合譜圖分析和香味物質(zhì)強(qiáng)度，最終確定了金銀花精油的特征香味物質(zhì)為5種，它們分別為苯乙醇、異戊酸香葉酯、羥基香茅醛、芳樟醇和壬酸烯丙酯。

金銀花精油整體香氣特征為清香、花香感較重，果香感也比較明顯，并伴有蜜甜香、茴香和輕微酸香。而這5種金銀花精油的特征香味組分，其中羥基香茅醛、芳樟醇均帶有青香，主要為清新感的香氣，與整體香氣特征清香相一致；壬酸烯丙酯、異戊酸香葉酯以果甜為主，與整體香氣特征的果香感較一致；苯乙醇具有蜜甜花香，是玫瑰花油的主要成分之一，是配制玫瑰香精和茉莉等花香型香精的“必用成分”；與金銀花整體香氣特征花香、蜜甜香相一致。因此5種金銀花精油的特征香味成分均與金銀花精油整體香氣相協(xié)調(diào)，是構(gòu)成金銀花精油整體香韻的主要貢獻(xiàn)組分。

金銀花精油整體香氣特征為清香、花香感較重，果香感也比較明顯，并伴有蜜甜香、茴香和輕微酸香。而清香、甜香、辛香和果香這些香韻都是卷煙加香上重要的香韻特征，添加在卷煙上，金銀花精油的功能顯著，能起到協(xié)調(diào)煙香，提升煙氣的清甜香和果香，并且增加甜潤(rùn)感，使煙氣清雅細(xì)膩。金銀花精油特征香味組分中，羥基香茅醛、芳樟醇氧化物賦予卷煙清新的香氣，提升煙氣細(xì)膩度；壬酸烯丙酯、異戊酸香葉酯以果甜為主，增加卷煙的潤(rùn)甜感、改善余味；苯乙醇具有蜜甜花香，與煙氣協(xié)調(diào)，提升煙氣飄逸感。由此，將金銀花精油添加在卷煙商，能夠與煙氣協(xié)調(diào)，增加了卷煙香氣量，突出清香，花香、果香和蜜甜香有輕微增加；提高了煙氣豐富度，并能有效將雜氣掩蓋。

表4 金銀花精油香氣組分的香氣強(qiáng)度

表4(續(xù))

3 結(jié)論與討論

采用2種方法提取金銀花揮發(fā)油；添加在卷煙中，金銀花揮發(fā)油均有提高卷煙的清甜花香感、細(xì)膩煙氣、提高煙氣豐富性等作用。其中，金銀花精油的評(píng)分最高，更好地提升了煙氣自然清新感、甜潤(rùn)感。對(duì)金銀花精油進(jìn)行GC-MS成分檢測(cè)，共檢測(cè)出70種化合物；其中，環(huán)氧芳樟醇比例最高，占比是10.07%。GC-O法檢測(cè)分析表明，苯乙醇(蜜甜花香)、異戊酸香葉酯(果甜香)、羥基香茅醛(青香)、芳樟醇(花青香)和壬酸烯丙酯(果香)，是金銀花精油的特征香味組分。

對(duì)香氣特征組分的綜合分析表明，金銀花精油在卷煙加香上具有很好的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)對(duì)金銀花精油GC-O和GC-MS的綜合分析，確定了金銀花精油的特征香氣及其成分基礎(chǔ)，建立了一套完整的金銀花精油香氣分析研究方法，分析和確定其精油的特殊信息，如香氣閾值，特征香氣組分等，并研究了金銀花精油在卷煙中的應(yīng)用。對(duì)于分析金銀花精油的香味性能，了解金銀花精油的香味成分以及每種香味成分對(duì)整體香氣特性的貢獻(xiàn)，以及對(duì)金銀花香料制品在香料行業(yè)的進(jìn)一步應(yīng)用具有重要的參考意義。