陶 洪 吳福道 張小靜 胡 芳

(四川省達州市中心醫(yī)院腫瘤科，達州 635000)

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，目前臨床治療手段有限，轉(zhuǎn)移快，死亡率高，對人類健康造成巨大威脅[1]。目前，早期胰腺癌患者主要采取手術治療，預后相對較好，然而絕大部分患者發(fā)現(xiàn)時已是中晚期，治療只能以放化療為主，控制率低，復發(fā)轉(zhuǎn)移率高，預后極差，此外，化療耐藥是導致胰腺癌治療效果不理想的重要原因[2-4]。近年來，醫(yī)學研究越來越精準化，越來越多的證據(jù)表明腫瘤干細胞的存在是腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移及耐藥的主要原因，然而腫瘤干細胞在腫瘤發(fā)病中的具體機制尚未完全闡明[5,6]。因此，進一步探討胰腺癌干細胞在干性維持及耐藥性中的作用機制，對于改善中晚期患者的預后極為重要。轉(zhuǎn)錄因子SOX2(sex determining region Y-box2)是SOX區(qū)域Y相關的HMG(high mobility group)蛋白家族成員之一，在哺乳動物的生長發(fā)育中起重要作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)SOX2是干細胞自我更新維持多項分化潛能的重要因子，在乳腺癌、肝癌以及非小細胞肺癌等腫瘤中均出現(xiàn)差異表達，且通過調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等過程促進腫瘤細胞惡性進展，在腫瘤干細胞的干性維持中亦起著關鍵調(diào)控作用[8-13]。本研究以上述背景為基礎，以PCSC及胰腺癌細胞株PACN-1為研究對象，通過多種實驗驗證SOX2在胰腺癌干細胞干性維持以及化療耐藥中的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 胰腺癌細胞株PACN-1(上海生命科學院細胞和生物化學研究所)；堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子均購自(美國Gibco公司)；MTT增殖檢測、細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物技術有限公司)；RIPA組織裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；蛋白濃度檢測試劑BCA液(美國Thermo公司)；Sh-SOX2 慢病毒(上海吉凱基因公司)；SOX2引物(廣州銳博生物科技有限公司)；兔抗人SOX2抗體(ab97959)、兔抗人Oct4抗體(ab181557)、兔抗人Nanog抗體(ab109250)、cyclinD1(ab16663)、兔抗人Caspase-3抗體(ab32351)、兔抗人Caspase-9抗體(ab32539)(abcam公司)；鼠抗人GAPDH抗體(60004-1-Ig，proteintech公司)；吉西他濱(江蘇倍達醫(yī)藥科技有限公司)。

1.1.2儀器 倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(美國BD 公司)；高速離心機(德國Beckman公司)；恒溫搖床(上海世平實驗設備有限公司)；凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司)；酶標儀(美國Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1PACN-1細胞分離和PCSC的培養(yǎng) 將液氮中取出的PACN-1置于37℃恒溫水浴鍋內(nèi)，使細胞快速復溫，待完全溶解后800 r/min離心3 min，棄上清，取1 ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸后移至25 cm的小瓶中培養(yǎng)，以上操作均在超凈工作臺內(nèi)完成，待細胞長滿后轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)(含有表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子)。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，2周左右時懸浮細胞腫瘤球開始形成，流式細胞儀分選CD133+的PCSC，無血清培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。

1.2.2Sh-SOX2病毒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選 取對數(shù)生長期的PCSC細胞接種至6孔板中，將包裝質(zhì)粒以及目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T中，48 h后收集病毒，按說明書將慢病毒轉(zhuǎn)染試劑polybrene與Sh-SOX2、Sh-NC轉(zhuǎn)染至細胞中，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8 h后更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2 μg/ml嘌呤霉素篩選出成功敲除SOX2的細胞株，擴大培養(yǎng)。此外，Rescue組先轉(zhuǎn)染Sh-SOX2，并構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株后，再轉(zhuǎn)入SOX2過表達質(zhì)粒(PcDNA3.1-SOX2)作為Rescue組。

1.2.3MTT檢測細胞增殖能力 取Sh-SOX2慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液，玻璃板計數(shù)后接種于96孔板(3000個/孔)，每個轉(zhuǎn)染組細胞設6個復孔，放至37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在鋪板后第0、1、2、3、4、5天測定570 nm波長處各組細胞的吸光度 (OD值)。150 μl培養(yǎng)基中加入20 μl MTT工作液，培養(yǎng)箱中孵育6 h后待活細胞與MTT試劑完全結(jié)合后棄上清，DMSO溶解紫色結(jié)晶，測定OD值，重復3次。

1.2.4軟瓊脂克隆形成實驗檢測腫瘤細胞干性 取對數(shù)生長期的PCSC細胞，0.25%胰酶消化后離心，重懸，制成單細胞懸液。5%的瓊脂糖高溫滅菌后42℃水浴，加入9倍體積完全培養(yǎng)基混勻，使瓊脂糖終濃度為0.5%，取0.8 ml上述液體澆注至24孔板，室溫凝固。同時取0.6 ml 50℃的5%瓊脂糖加入9.4 ml 500個細胞的培養(yǎng)基中，迅速混勻，取0.8 ml鋪至底層凝脂，室溫凝固后放置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設置2個復孔，在顯微鏡下觀察并拍照，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)14～16 d。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 用無EDTA的胰酶消化轉(zhuǎn)染SOX2沉默慢病毒載體72 h后的各組細胞，PBS洗3次后，收集轉(zhuǎn)染組細胞，按照說明書分別加入Binding Buffer、7-ADD以及Annexin V-APC染液，混勻后室溫避光孵育10～15 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6Western blot檢測各組細胞CyclinD1、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達情況 收集各處理組(NC、Sh-SOX2及Rescue組)的PCSC細胞，加入120 μl 含有1%PMSF的RIPA細胞冰上裂解15 min后刮刀刮取細胞(超聲破碎儀裂解10 min)；離心(14 000 g，4℃，30 min)，BCA 法測定細胞蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)、8%脫脂奶粉封閉3 h，一抗孵育過夜，二抗孵育2 h，TBST洗滌2次后，化學發(fā)光底物曝光條帶。GAPDH 作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1PCSC的篩選及鑒定 將PACN-1腫瘤球利用流式細胞儀篩選出CD133+細胞，并將CD133+細胞繼續(xù)培養(yǎng)后收集足量細胞提取蛋白，結(jié)果顯示CD133+細胞中干性相關基因Oct4、Nanog的表達顯著高于CD133-細胞中的表達，表明篩選成功。此外SOX2蛋白在CD133+的細胞中的表達顯著升高，見圖1，提示CD133+細胞為PCSC細胞。

2.2MTT檢測抑制PCSC中SOX2的表達對細胞增殖能力影響 與對照組相比，Sh-SOX2組細胞增殖能力顯著降低，過表達SOX2后，增殖能力得到恢復，見圖2，SOX2促進胰腺癌干細胞增殖。

圖1 Western blot檢測流式細胞篩選CD133+和CD133-細胞中干性相關基因(Oct4、Nanog)及SOX2蛋白的表達Fig.1 Expression of stemness related genes (Oct4,Nanog) and SOX2 protein in CD133+ and CD133- cells screened by flow cytometry detected by Western blot

圖2 MTT檢測SOX2對細胞增殖活性的影響Fig.2 Effect of Sox2 on cell proliferation by MTT Note: Compared with Sh-NC,*.P<0.05；compared with Sh-SOX2,#.P<0.05.

圖3 軟瓊脂克隆實驗檢測SOX2表達對PCSC干性的影響Fig.3 Effect of SOX2 expression on stemness of PCSC detected by soft agar assay

2.3軟瓊脂克隆實驗檢測SOX2對PCSC干性的影響 軟瓊脂克隆實驗顯示Sh-SOX2組細胞的克隆形成能力顯著降低(P<0.05)，見圖3。

2.4MTT檢測各組對吉西他濱的耐藥性 2 μg/ml吉西他濱處理48 h后，檢測并統(tǒng)計各組細胞的IC50值，結(jié)果提示，與對照組相比，Sh-SOX2組細胞的IC50值明顯降低，與Sh-SOX2組相比，Rescue組細胞的IC50值部分恢復(P<0.05)，見圖4。

2.5流式檢測吉西他濱干預后各組細胞的凋亡比

例 2 μg/ml吉西他濱處理48 h后，流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率，結(jié)果提示，與對照組相比，Sh-SOX2組細胞的凋亡率明顯升高，與Sh-SOX2組相比，Rescue組細胞的凋亡率明顯降低，見圖5。

圖4 MTT法檢測SOX2對吉西他濱IC50值Fig.4 Detection of IC50 value of SOX2 to gemcitabine by MTTNote: Compared with Sh-NC，*.P<0.05.

圖5 流式細胞術檢測細胞凋亡Fig.5 Apoptosis was detected by flow cytometry

圖6 Western blot檢測各處理組Caspase-3及Caspase-9蛋白的表達水平Fig.6 Western blot was used to detect expression level of Caspase-3 and Caspase-9 in each treatment group

2.6Western blot檢測SOX2對CSC凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9表達的影響 與對照組相比，Sh-SOX2組Caspase-3及Caspase-9表達水平顯著升高，Rescue組較Sh-SOX2組Caspase-3及Caspase-9表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖6。

3 討論

胰腺癌是死亡率最高的惡性腫瘤之一，患者5年生存率僅約8%，胰腺導管腺癌是其最常見的類型，且早期診斷率低、惡性程度高、易發(fā)生放化療抵抗[14]。研究發(fā)現(xiàn)，吉西他濱耐藥是導致胰腺癌化療失敗的主要原因。因此，進一步闡明胰腺癌患者吉西他濱耐藥機制對于提高中晚期患者療效，改善患者預后至關重要。干細胞是機體中存在的一群具有自我更新及多項分化潛能的細胞。近年來，多項研究提示腫瘤干細胞的存在是導致腫瘤復發(fā)及轉(zhuǎn)移的主要原因，且與化療耐藥密切相關。有研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌中也存在腫瘤干細胞，但其在胰腺癌中的作用機制尚未完全闡明。腫瘤干細胞的存在是導致腫瘤無法根治的主要原因[15，16]。因此，尋找腫瘤干細胞致癌及化療耐藥的具體機制將為腫瘤治療提供新的策略。

SOX2是機體重要的轉(zhuǎn)錄因子，屬于SOX基因家族的一員，在機體的生長發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育及血細胞形成等過程中均起重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)SOX2是一個腫瘤細胞干性相關基因，在腫瘤細胞增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Yao等[18]發(fā)現(xiàn)SOX2可促進三陰乳腺癌的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移；Wei等[19]發(fā)現(xiàn)SOX2可通過調(diào)控PI3K/AKT通路促進膽管癌細胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)SOX2與肝細胞癌干細胞干性相關，且與胃癌干細胞增殖相關[20，21]。SOX2可通過調(diào)控細胞周期相關蛋白CyclinD1、cmyc等加快細胞周期，可通過抑制凋亡相關蛋白的表達抑制細胞凋亡[22]。Caspase-3與Caspase-9為含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶家族成員[23]。因此，本研究假設在胰腺癌中，SOX2可能與胰腺癌干細胞干性及吉西他濱化療耐藥相關，且該功能的實現(xiàn)是通過調(diào)控細胞凋亡相關蛋白實現(xiàn)的。本研究通過懸浮腫瘤球形成實驗從人胰腺癌細胞系PACN-1中分離出CD133+的PCSC，采用Western blot技術、軟瓊脂克隆實驗、慢病毒沉默技術、MTT實驗、流式細胞凋亡檢測技術等來證明設想。結(jié)果提示：SOX2與胰腺癌干細胞干性維持以及吉西他濱化療耐藥顯著相關。且SOX2通過調(diào)控Caspase-3及Caspase-9蛋白進而調(diào)控細胞凋亡、介導胰腺癌細胞吉西他濱耐藥。

綜上所述，SOX2在CD133+的胰腺癌干細胞中顯著高表達，抑制其表達可以顯著降低胰腺癌細胞干性，降低其對吉西他濱的耐藥性，機制可能是通過作用于凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-9的表達。本研究為治療胰腺癌提供新的策略，SOX2可能成為胰腺癌治療的潛在靶點。