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        植物乳桿菌67干預(yù)頻次及周期對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響

        2020-07-13 11:48:56黃玉軍顧瑞霞
        食品科學(xué) 2020年11期
        關(guān)鍵詞:臟器灌胃高脂血癥

        黃玉軍,姚 瑤,周 帆,顧瑞霞*

        (揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州 225127)

        高脂血癥是由于機(jī)體脂質(zhì)代謝異常而引起的一種疾病,是引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的重要原因[1-3]。隨著國(guó)民生活水平的提高和大眾飲食習(xí)慣的改變,近年來(lái)血脂異常人數(shù)急速上升[4],與血脂代謝異常相關(guān)的疾病頻發(fā),每年全世界與高血脂癥相關(guān)疾病導(dǎo)致死亡的人數(shù)達(dá)到3 000多萬(wàn),且患病率和死亡率仍在上升[5-6]。他汀類藥物能夠有效降低血清中低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity liptein cholesterol,LDL-C)水平,在治療代謝性疾病和心腦血管疾病中有重要的地位[7]。但隨著研究的深入,這類藥物帶來(lái)的副作用也逐漸被發(fā)現(xiàn),他汀類藥物會(huì)造成肝損傷[8]、腎衰竭[9]等不良反應(yīng)。隨著藥物副作用越來(lái)越多地被報(bào)道,益生菌作為藥物替代品用于降膽固醇已成為研究熱點(diǎn)。

        近年來(lái),國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明,益生菌有許多健康功效,如調(diào)節(jié)胃腸道健康、抑制病原微生物、增強(qiáng)免疫應(yīng)答和降低血清膽固醇等[10-13],最重要的是能有效控制血清中總膽固醇(total cholesterol,TC)、總甘油三酯(total triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity liptein cholesterol,HDL-C)和LDL-C水平,有一定的降脂作用[14-16]。關(guān)于益生菌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基本均采用連續(xù)定時(shí)定量灌胃[17-19],這種灌胃方式雖然能確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每日定量攝入益生菌,但缺乏實(shí)際操作性。對(duì)于普通人群來(lái)說(shuō),較難做到每日定時(shí)定量食用益生菌,并且容易產(chǎn)生心理厭倦。因此,本實(shí)驗(yàn)參考近年來(lái)被研究證明具有減肥作用且安全的“間歇性斷食法”[20-22],利用具有較好降膽固醇效應(yīng)的益生菌植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,Lp)67,通過(guò)改變干預(yù)頻次提出了2 種新的干預(yù)方式,并從干預(yù)4、6 周和8 周3 個(gè)階段分析益生菌干預(yù)頻次和周期對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物、材料與試劑

        體質(zhì)量150~180 g的5 周齡SPF級(jí)Wistar雄性大鼠(n=126;生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)2002-0009;使用許可證號(hào):SYXK(蘇)2002-0045) 揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

        基礎(chǔ)飼料(20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)面粉、10%米粉、20%玉米、26%麩皮、20%豆料、2%魚粉、2%骨粉)、高脂飼料(78.8%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.2%膽鹽) 南京協(xié)同生物醫(yī)藥有限公司。

        Lp67由揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制實(shí)驗(yàn)室分離保藏;TC、TG、LDL-C、HDL-C檢測(cè)試劑盒南京建成生物工程有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;Legend mach1.6R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;7020型全自動(dòng)生化分析儀 日本日立制作所。

        1.3 方法

        1.3.1 灌胃菌液的制備

        灌胃前3 d將-80 ℃保存的凍干菌粉取出進(jìn)行活化,灌胃前1 d將活化3 代的菌株培養(yǎng)液于4 500 r/min離心15 min,用生理鹽水清洗并重懸2 次,配制活菌數(shù)為108CFU/mL的菌懸液,置于4 ℃冰箱保存。根據(jù)大鼠體質(zhì)量,以1 mL/100 gmb計(jì)算灌胃劑量。

        1.3.2 動(dòng)物分組及處理

        動(dòng)物房保持通風(fēng)、透光、清潔衛(wèi)生,室溫(23.0±1.0)℃、相對(duì)濕度(50±5)%條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。適應(yīng)期結(jié)束后,按各組間大鼠平均體質(zhì)量無(wú)差異分為正常組(n=27)和高脂組(n=99)。正常組飼喂基礎(chǔ)飼料,高脂組飼喂高脂飼料4 周進(jìn)行高血脂癥大鼠造模。造模成功后將高脂組大鼠按體質(zhì)量無(wú)差異分為4 組:模型組(n=24)、Lp67菌株5:2干預(yù)組(n=24)、Lp67菌株隔日干預(yù)組(n=24)及Lp67菌株連續(xù)干預(yù)組(n=24)。灌胃4、6 周和8 周時(shí),各組隨機(jī)選取8 只大鼠進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。各組大鼠具體灌胃信息如表1所示。

        表1 實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù)方式Table 1 Experimental grouping and intervention treatments

        1.3.3 主要指標(biāo)的測(cè)定

        1.3.3.1 觀察大鼠生長(zhǎng)狀態(tài)

        實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠皮毛、活動(dòng)及糞便等情況,每周固定時(shí)間稱量1 次體質(zhì)量。

        1.3.3.2 臟器指數(shù)計(jì)算

        大鼠禁食12 h后,稱量并記錄空腹體質(zhì)量(m1/g),脫臼處死,解剖后取完整的心臟、肝臟、脾臟和腎臟,洗凈血液,吸干水分后稱質(zhì)量(m2/g)。按式(1)計(jì)算臟器指數(shù)。

        1.3.3.3 血清制備與血脂水平檢測(cè)

        大鼠禁食12 h后,脫臼處死,眼球取血,4 ℃、5 000 r/min離心10 min,收集上層血清,取300 μL血清樣品用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C濃度。按式(2)計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(atherosclerosis index,AI)。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 16.0軟件中的方差分析進(jìn)行差異顯著性比較。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 高脂血癥大鼠模型的建立

        飼喂第4 周,對(duì)照組和模型組隨機(jī)各選取3 只大鼠,測(cè)定血清TC、TG、LDL-C及HDL-C濃度。

        表2 益生菌Lp 67干預(yù)前大鼠血脂狀況(n=3)Table 2 Blood lipid indexes of rats before probiotic Lp 67 intervention (n= 3)

        由表2可知,與正常組相比,模型組大鼠血清TC、TG和LDL-C濃度顯著升高(P<0.05),HDL-C濃度顯著下降(P<0.05),表明造模成功。

        2.2 益生菌干預(yù)期間大鼠的一般行為學(xué)觀察結(jié)果

        圖1 益生菌Lp 67干預(yù)期間大鼠體質(zhì)量變化(n=8)Fig. 1 Changes in body mass rats during probiotic Lp 67 intervention (n = 8)

        體質(zhì)量是最直觀的可用于觀察機(jī)體是否發(fā)生病變的指標(biāo)。如圖1所示,干預(yù)前4 周,各組大鼠體質(zhì)量逐漸增長(zhǎng),但變化不大;干預(yù)4~6 周時(shí),各組大鼠體質(zhì)量均呈先降低后升高的趨勢(shì),且不論有無(wú)益生菌干預(yù),大鼠體質(zhì)量均出現(xiàn)低谷,說(shuō)明可能此時(shí)機(jī)體自身的應(yīng)激機(jī)制發(fā)揮作用,控制體質(zhì)量增長(zhǎng),益生菌Lp67干預(yù)組則是由益生菌作用和自身應(yīng)激機(jī)制疊加作用,因此,3 組干預(yù)組大鼠體質(zhì)量均低于模型組,且5∶2干預(yù)組大鼠體質(zhì)量最低,說(shuō)明該組的益生菌干預(yù)方式和自身機(jī)體機(jī)制共同作用控制體質(zhì)量增長(zhǎng)的效果最好;干預(yù)6 周后,模型組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng),干預(yù)組大鼠體質(zhì)量增速減緩,說(shuō)明益生菌干預(yù)有助于控制體質(zhì)量增長(zhǎng),這與張曉磊等[23]的研究結(jié)果一致。與其他干預(yù)組相比,5∶2干預(yù)組大鼠體質(zhì)量較高,說(shuō)明5∶2干預(yù)組的干預(yù)方式不適合用于長(zhǎng)期干預(yù),連續(xù)和隔日干預(yù)組大鼠體質(zhì)量后期波動(dòng)較大,這可能是由于大鼠機(jī)體損傷較嚴(yán)重導(dǎo)致。綜合考慮時(shí)間、菌株利用率和機(jī)體健康狀態(tài)等,對(duì)高脂血癥大鼠體質(zhì)量干預(yù)效果最好的是Lp67菌懸液1 周干預(yù)5 次的5∶2干預(yù)組,最佳干預(yù)時(shí)間為4~6 周。

        2.3 益生菌干預(yù)頻次及周期對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響

        臟器指數(shù)能進(jìn)一步說(shuō)明內(nèi)部器官是否受損[24],當(dāng)人或動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)狀況出現(xiàn)異常時(shí),臟器外觀、質(zhì)量等會(huì)發(fā)生改變[25]。對(duì)臟器外觀進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),除了肝臟,其余臟器并無(wú)發(fā)生肉眼可見(jiàn)的病變,這與王瓊等[26]的研究一致。正常組大鼠肝臟呈鮮紅色,外部光滑有色澤,邊緣清晰,模型組與干預(yù)組大鼠肝臟顏色發(fā)白、無(wú)光澤,且體積變大。

        表3 益生菌Lp 67干預(yù)4 周后大鼠的臟器指數(shù)(n=8)Table 3 Visceral organ indexes of rats after 4 weeks of probiotic Lp 67 intervention (n= 8)

        表4 益生菌Lp 67干預(yù)6 周后大鼠的臟器指數(shù)(n=8)Table 4 Visceral organ indexes of rats after 6 weeks of probiotic Lp 67 intervention (n= 8)

        表5 益生菌Lp 67干預(yù)8 周后的大鼠臟器指數(shù)(n=8)Table 5 Visceral organ indexes of rats after 8 weeks of probiotic Lp 67 intervention (n= 8)

        由表3~5可知,干預(yù)4~8 周大鼠各臟器指數(shù)變化情況大致相同,各組大鼠的心臟、脾臟和腎臟指數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05);與模型組相比,干預(yù)組大鼠肝臟指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。肝臟指數(shù)增大,說(shuō)明飼喂高脂飼料造成大鼠肝臟脂肪堆積、增生和肥大等問(wèn)題,但對(duì)心臟、脾臟和腎臟的影響較小。干預(yù)4 周和6 周后,3 組干預(yù)組大鼠的肝臟指數(shù)均顯著低于模型組,且組間均表現(xiàn)為連續(xù)干預(yù)組>5∶2干預(yù)組>隔日干預(yù)組的規(guī)律。干預(yù)8 周后,隔日干預(yù)組大鼠肝臟指數(shù)上升幅度較大,連續(xù)干預(yù)組大鼠肝臟指數(shù)上升幅度較小,因此灌胃結(jié)束時(shí),隔日干預(yù)組大鼠肝臟指數(shù)最大,5∶2干預(yù)組次之,連續(xù)干預(yù)組最小,與干預(yù)4~6 周不同,說(shuō)明隔日干預(yù)組和連續(xù)干預(yù)組這2 種干預(yù)方式的穩(wěn)定性較差。因此,選擇較穩(wěn)定的5∶2干預(yù)組更有利于肝臟的恢復(fù)。此外,干預(yù)4 周時(shí),5∶2干預(yù)組大鼠肝臟指數(shù)與模型組差異較大,這與文獻(xiàn)[27]中報(bào)道的益生菌干預(yù)1 個(gè)月有利于減少肝臟脂肪堆積的結(jié)果一致;干預(yù)6 周時(shí)大鼠肝臟指數(shù)與模型組相比差值減小,至干預(yù)8 周時(shí)差值進(jìn)一步減小,這可能是由于實(shí)驗(yàn)前期肝臟病癥較輕,干預(yù)作用較明顯。綜上所述,Lp67菌懸液1 周干預(yù)5 次的5∶2干預(yù)組肝臟指數(shù)變化最穩(wěn)定,且干預(yù)6 周后的肝臟情況最好。

        2.4 益生菌干預(yù)頻次及周期對(duì)大鼠血脂的影響

        血清TC、TG和LDL-C水平的升高均是引起動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素,TC、TG、LDL-C及HDL-C水平是臨床用于診斷高脂血癥的重要指標(biāo)[28]。AI是醫(yī)學(xué)上用來(lái)衡量動(dòng)脈粥樣硬化程度的指標(biāo),AI高則心血管疾病的發(fā)病率高[29]。

        表6 益生菌Lp 67干預(yù)期間的大鼠血脂指標(biāo)變化(n=8)Table 6 Changes in serum biochemical indicators of rats during probiotic Lp 67 intervention (n= 8)

        由表6可知,干預(yù)期間,與模型組相比,各干預(yù)組血清TC、TG、LDL-C濃度及AI均顯著下降(P<0.05),HDL-C濃度不同程度地升高,這一結(jié)果與韋云路[30]、張澤生[31]等的研究結(jié)果一致。干預(yù)期間,各干預(yù)組大鼠血清HDL-C濃度持續(xù)升高且升高幅度也不斷增大,干預(yù)6 周和8 周時(shí)5∶2干預(yù)組大鼠血清HDL-C濃度與正常組最接近。干預(yù)8 周的連續(xù)干預(yù)組大鼠血清LDL-C濃度改善效果最佳,其次是干預(yù)8 周的5∶2干預(yù)組。干預(yù)6 周的5∶2干預(yù)組與模型組相比,TC濃度相差最大,其次是干預(yù)8 周的連續(xù)干預(yù)組和5∶2干預(yù)組。對(duì)于血清TG濃度,干預(yù)6 周的5∶2干預(yù)組改善效果最佳,與模型組相比差異最為顯著。此外,5∶2干預(yù)組大鼠干預(yù)期間AI先降低后升高,AI在干預(yù)6 周最低,說(shuō)明以5∶2干預(yù)組的方式干預(yù)6 周后大鼠發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)最低。綜上所述,Lp67菌懸液1 周干預(yù)5 次的5∶2干預(yù)組干預(yù)6 周,對(duì)高脂血癥大鼠血脂狀況的改善效果最好、影響最顯著。以上結(jié)果表明,益生菌干預(yù)改善血脂狀況對(duì)干預(yù)時(shí)間依賴性較弱,可能更需要考慮所選用菌株及干預(yù)頻次。

        3 結(jié) 論

        本研究通過(guò)建立高脂血癥大鼠模型,利用實(shí)驗(yàn)室分離保藏具有較好體外降膽固醇作用的Lp67,結(jié)合近年來(lái)被認(rèn)為可用于減肥人群使用且安全性較高的“間歇性斷食法”,設(shè)計(jì)了2 種干預(yù)方式,從體質(zhì)量、臟器指數(shù)及血清血脂生化指標(biāo)方面分析益生菌Lp67干預(yù)頻次及周期對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響。結(jié)果表明,Lp67 1 周干預(yù)5 次對(duì)降低高脂血癥大鼠體內(nèi)膽固醇有一定改善作用,且綜合考慮各項(xiàng)指標(biāo)可知,作用周期以干預(yù)6 周為最佳。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為益生菌間歇性干預(yù)降低高脂血癥大鼠血脂的研究提供了依據(jù),并為提高益生菌的利用率提供了數(shù)據(jù)支持,但該種干預(yù)方式是否為人體最佳的益生菌食用方式仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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