杜 琛，尹歡歡，趙城彬*，許秀穎，曹 勇，吳玉柱，張 浩，劉景圣*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130118）

葉黃素是一種具有抗氧化作用的天然類胡蘿卜素，廣泛存在于綠色植物中，在玉米、萬壽菊中含量豐富。有越來越多的證據(jù)表明葉黃素可以改善人體健康，延緩老化，并且能夠抑制白內(nèi)障和黃斑變性這兩種常見眼病的發(fā)生[1]。紅豆（Phaseolus angularis）又名赤豆，是一種高蛋白、低脂肪、營養(yǎng)豐富的食品。Meng等[2]對(duì)紅豆中的蛋白質(zhì)做了詳細(xì)的研究，發(fā)現(xiàn)紅豆中約50%的蛋白質(zhì)為球蛋白，其中7S球蛋白為主要的組成成分，11S球蛋白次之；紅豆球蛋白的氨基酸組成優(yōu)于聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)，通過圓二色譜研究發(fā)現(xiàn)，紅豆蛋白富含α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角。

近年來，蛋白質(zhì)與具有抗氧化作用的小分子如茶多酚、花青素、姜黃素、槲皮素等物質(zhì)結(jié)合后發(fā)生物理化學(xué)性質(zhì)的變化以及發(fā)生變化后的蛋白質(zhì)對(duì)于健康的影響已經(jīng)成為研究的一大熱點(diǎn)。Chen Gang等[3]發(fā)現(xiàn)添加0.08%的茶多酚能夠使大豆蛋白溶解度增加至0.50 g/mL，乳化活性提高約3 倍，達(dá)43.5%。Sui Xiaonan等[4]指出花青素的加入改變了大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致β-折疊含量減少，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量增加。Chen Feiping等[5]報(bào)道了超聲處理下大豆分離蛋白與姜黃素絡(luò)合顯著增加了蛋白質(zhì)的粒徑和ζ-電位，但導(dǎo)致表面疏水性的降低。Wang Yufang等[6]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素與大豆蛋白結(jié)合后，其2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)自由基清除能力優(yōu)于游離槲皮素。目前，蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合的研究多集中于動(dòng)物蛋白，如乳蛋白、魚類蛋白、牛血清白蛋白等，植物蛋白主要是大豆蛋白，而與紅豆蛋白結(jié)合的研究相對(duì)較少。

超聲波處理技術(shù)引起了食品工業(yè)的日益關(guān)注。超聲波在食品中可用于輔助提取、滅菌、乳化、結(jié)晶、干燥等，主要是利用超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)及熱效應(yīng)等。Hu Hao等[7]報(bào)道大豆蛋白的游離巰基含量、表面疏水性和溶解度經(jīng)超聲波處理后均增加，而這些性質(zhì)的改變可能有利于蛋白質(zhì)與葉黃素的結(jié)合。為研究超聲處理能否促進(jìn)紅豆蛋白與葉黃素的結(jié)合，從而提高葉黃素對(duì)紅豆蛋白的修飾和功能改善作用，本實(shí)驗(yàn)采用超聲處理制備紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物，采用差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC）和傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀分析其熱特性和二級(jí)結(jié)構(gòu)，并研究其表面疏水性、巰基含量、溶解度、起泡和乳化特性，試圖探究結(jié)構(gòu)變化與功能性質(zhì)改善之間的構(gòu)效關(guān)系，從而為研發(fā)功能性紅豆蛋白及其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料所用紅豆為‘白紅11號(hào)’（蛋白質(zhì)21.59%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、淀粉56.82%、脂肪0.74%、纖維7.98%、水分8.12%、灰分3.43%），購自吉林省白城市，將紅豆中不完整的、有蟲眼的顆粒及雜質(zhì)除去，挑選顆粒光滑飽滿、大小均勻的籽粒作為實(shí)驗(yàn)材料。玉米葉黃素為小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室自制。

8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonate，ANS） 上海源葉生物科技有限公司；溴化鉀、5,5’-二巰基-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB） 美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 美國Genview公司；乙酸乙酯（純度99.5%）、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；ST300 pH計(jì)奧豪斯儀器（常州）有限公司；PC-620D磁力攪拌器美國Corning公司；723PC可見分光光度計(jì) 上海歐茂儀器有限公司；JY98-IIIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；K1100全自動(dòng)凱氏定氮儀濟(jì)南海能儀器股份有限公司；FLUO star Omega多功能酶標(biāo)儀 德國BMG LRBTECH公司；Alpha1-4LDplus冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；Q2000 DSC 美國TA公司；VERTEX 70 FTIR儀 德國Bruker公司；FA28間歇式高剪切機(jī) 德國Fluko公司。

1.3 方法

1.3.1 紅豆蛋白提取

根據(jù)徐向東[8]的方法，并稍作修改。稱取豆粒，按1∶5（m/V）的比例加入蒸餾水在室溫下浸泡24 h。將浸泡過的豆瓣去除種皮和胚芽，并沖洗干凈。分批按質(zhì)量比1∶3加入蒸餾水后利用打漿機(jī)將其充分打磨成漿，將豆渣和豆?jié){的混合物過100 目篩，此步驟重復(fù)3～4 次，棄去篩上物。用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8～9，室溫下攪拌4 h，使蛋白質(zhì)充分溶解，用離心機(jī)4 000 r/min離心15 min。分離上清液，將沉淀重復(fù)以上步驟，合并上清液。將所得溶液用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，室溫下攪拌30 min，4 000 r/min離心15 min，將沉淀復(fù)溶后用HCl、NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH值為7，然后冷凍干燥即得到紅豆蛋白。采用凱氏定氮法（GB/T 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》）測定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，得到紅豆蛋白中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為79.87%。

1.3.2 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物制備

將紅豆蛋白溶解于pH 7.4、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，用磁力攪拌器攪拌4 h形成1 g/100 mL的蛋白溶液，保存在4 ℃下。將葉黃素分散在乙醇中使其濃度為2 mmol/L，貯存在4 ℃下備用。在磁力攪拌下將葉黃素溶液逐漸滴加到紅豆蛋白溶液中，使葉黃素濃度為60 μmol/L，而蛋白質(zhì)量濃度保持不變，在室溫下繼續(xù)攪拌1 h，得到紅豆蛋白-葉黃素混合液。將混合液置于冰浴中，使其溫度低于2 ℃，然后將超聲探頭插入液面以下，距離溶液底部1 cm處，在20 kHz的頻率下按表1進(jìn)行超聲處理，超聲處理采用間歇式，即每次超聲4 s，間隔2 s。對(duì)超聲處理后的溶液一部分進(jìn)行結(jié)合率的測定，另一部分溶液冷凍干燥，貯存在室溫下的密封袋中備用。對(duì)照組為未經(jīng)過超聲處理的紅豆蛋白-葉黃素混合液，其他操作與超聲處理的樣品相同。

表1 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物制備的超聲處理?xiàng)l件Table 1 Ultrasonic treatment conditions for preparation of red bean protein-lutein complexes

1.3.3 結(jié)合率的測定

將超聲處理后的溶液在5 000 r/min下離心20 min，取上清液進(jìn)行萃取。在攪拌條件下，按體積比為1∶3的比例加入乙酸乙酯萃取溶液30 s，然后靜置30 min，使其完全分離成乙酸乙酯和水層，測定上清液在500 nm波長處的吸光度。將2 mmol/L的葉黃素醇溶液加入到一定體積的乙酸乙酯中，使乙酸乙酯中葉黃素濃度分別為25、50、75、100、200 μmol/L，然后測定溶液在500 nm波長處的吸光度，得到以葉黃素濃度為x、吸光度為y的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝0.009 2x+0.012 8（R2＝0.999 2）。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到上清液的葉黃素濃度，再通過公式（1）計(jì)算葉黃素的結(jié)合率。

1.3.4 熱特性的測定

樣品的熱特性通過DSC測定，參考趙城彬等[9]的方法。稱取2 mg樣品粉末于鋁盤中，密封壓片后，放入DSC中準(zhǔn)備測定，以空鋁盤為對(duì)照，測定條件為掃描速率10 ℃/min，掃描范圍25～200 ℃。

1.3.5 FTIR光譜的測定

根據(jù)Zhao Chengbin等[10]的方法，使用FTIR儀分析樣品蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。將樣品與KBr以1∶100（m/m）混合均勻，并進(jìn)行壓片。光譜記錄在600～4 000 cm-1的范圍內(nèi)，并且以4 cm-1的分辨率進(jìn)行11 次掃描。通過Peakfit 4.12軟件擬合α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的特征峰。

1.3.6 表面疏水性的測定

按照Zhao Chengbin等[11]的方法并進(jìn)行了一些修改，使用熒光探針ANS測定樣品的表面疏水性。用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋樣品得到0.01、0.02、0.05、1.00 mg/mL溶液，取8 mmol/L的ANS溶液20 μL與蛋白質(zhì)溶液2 mL混合，并在25 ℃下靜置3 min。將試樣（200 μL）置于96 孔酶標(biāo)板中用于熒光強(qiáng)度（fluorescence intensity，F(xiàn)I）的測定。建立以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、FI值為縱坐標(biāo)的曲線，并將這些曲線的初始斜率作為表面疏水性。

1.3.7 巰基含量的測定

用Ellman試劑法[12]測定巰基含量。總巰基含量測定：用Tris-Gly緩沖液（含0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、0.04 mol/L EDTA，pH 8）配制質(zhì)量濃度為4 mg/mL的DTNB溶液，即Ellman試劑。測定時(shí)，將15 mg樣品溶于5 mL Tris-Gly緩沖液，加入50 μL Ellman試劑，在25 ℃條件下保溫反應(yīng)1 h，5 000×g離心10 min，取上清液在412 nm波長處測定吸光度，以等量蒸餾水替代樣品作為空白對(duì)照。游離巰基含量測定：除Tris-Gly緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、0.04 mol/L EDTA、8 mol/L尿素，pH 8）與總巰基含量測定時(shí)不同，其余步驟均相同。

1.3.8 溶解度的測定

將樣品溶液（5 mg/mL）以10 000×g離心20 min，收集上清液，通過凱氏定氮法測定氮含量/（g/g），蛋白質(zhì)溶解度通過公式（2）計(jì)算。

1.3.9 乳化性及乳化穩(wěn)定性測定

取10 mL 0.1 g/100 mL待測樣品溶液（樣品溶于pH 7的磷酸鹽緩沖液中），加入大豆油3 mL，在室溫下用均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌1 min，迅速從底部取樣，用0.1 g/100 mL的十二烷基硫酸鈉溶液將其稀釋100 倍，然后在500 nm波長處測定其吸光度（A0），以A0表征乳化性；在25 ℃下放置30 min后，再測500 nm波長處的吸光度（A30）。乳化穩(wěn)定性通過公式（3）計(jì)算。

1.3.10 起泡性及泡沫穩(wěn)定性測定

取20 mL 1 g/100 mL的樣品溶液使用均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min攪打2 min產(chǎn)生泡沫。記錄剛形成泡沫的樣品溶液的體積（V0/mL）；靜置30 min后，記錄體積（V30/mL）。起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別通過公式（4）、（5）計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有測定至少設(shè)3 個(gè)平行，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超聲處理下復(fù)合體系中紅豆蛋白與葉黃素的結(jié)合率

圖1 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的結(jié)合率Fig. 1 Binding rate of red bean protein-lutein complexes

如圖1所示，與未進(jìn)行超聲處理的對(duì)照組相比，在不同超聲處理?xiàng)l件下，紅豆蛋白與葉黃素的結(jié)合率得到不同程度的提高，由65.18%（對(duì)照組）提高到71.70%～91.82%，在240 W超聲處理10 min（處理5）時(shí)結(jié)合率達(dá)到最大，表明超聲處理可以促進(jìn)葉黃素與紅豆蛋白的結(jié)合。無論超聲功率的強(qiáng)弱，隨著超聲時(shí)間的延長，結(jié)合率先升高后下降；而超聲時(shí)間較短（5 min）時(shí)，結(jié)合率隨超聲功率升高而升高，超聲10 min時(shí)，呈先增加后減少的趨勢，超聲時(shí)間達(dá)20 min時(shí)，超聲功率越大其結(jié)合率反而越小。原因可能是適度的超聲處理會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的展開，使疏水基團(tuán)更多地暴露，從而導(dǎo)致超聲促進(jìn)了葉黃素與蛋白質(zhì)的結(jié)合；而過度超聲處理嚴(yán)重破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子重新聚集[13]，阻礙了其與葉黃素的結(jié)合。

2.2 不同超聲處理下紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的熱特性分析結(jié)果

圖2 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的DSC圖Fig. 2 Differential scanning calorimetric thermograms of red bean protein-lutein complexes

峰值溫度（Tp）反映蛋白質(zhì)的變性溫度，熱焓變（ΔH）表示誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性所需的熱量，而蛋白質(zhì)有序構(gòu)象的情況可以通過ΔH反映[14]。由圖2可知，所有紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物與紅豆蛋白都是在100 ℃附近出現(xiàn)一個(gè)吸收峰，經(jīng)過超聲處理的復(fù)合物比對(duì)照組的圖譜稍向左偏移。葉黃素晶體在157 ℃出現(xiàn)熔融峰，而復(fù)合物在此溫度未見熔融峰，說明葉黃素以無定形形式存在于粉末顆粒中，表明紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的形成。

表2為紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的熱力學(xué)參數(shù)。與紅豆蛋白相比，對(duì)照組的Tp由108.34 ℃下降至101.10 ℃，ΔH從283.90 J/g減少至270.90 J/g，說明紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的變性溫度降低，在變性時(shí)所需的熱量減少。超聲處理后復(fù)合物的Tp和ΔH進(jìn)一步降低，但是Tp下降得并不顯著（P＞0.05），而ΔH顯著下降（P＜0.05），且在240 W超聲處理10 min（處理5）時(shí)Tp和ΔH達(dá)到最低，這可能與此超聲條件下較高的結(jié)合率有關(guān)。此外，Nazari等[15]對(duì)超聲處理谷子蛋白的功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)超聲作用也能夠促使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散和無序化，這有可能利于蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的改善。然而，高功率長時(shí)間的超聲處理（360 W、20 min）又會(huì)使ΔH有所上升，這可能是蛋白質(zhì)分子重新聚集導(dǎo)致的[16]。

表2 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters of red bean protein-lutein complexes

2.3 不同超聲處理下紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的FTIR分析結(jié)果

由圖3可知，紅豆蛋白的FTIR光譜與紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物不同，主要是在3 100～3 600 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，復(fù)合物形成了較寬的強(qiáng)吸收峰，表明這些官能團(tuán)參與了與葉黃素的結(jié)合，形成了穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-葉黃素復(fù)合物，這一結(jié)果與Xiang Huan等[17]對(duì)大豆蛋白-姜黃素復(fù)合物的研究結(jié)果類似。葉黃素的加入引起了紅豆蛋白的酰胺II帶從1 572 cm-1移至1 541 cm-1處，說明葉黃素引起了紅豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。Shen Fei等[18]研究卵清蛋白和茶多酚的相互作用發(fā)現(xiàn)，在pH 7.5的條件下加入茶多酚后卵清蛋白的酰胺I、II帶發(fā)生藍(lán)移。常用酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）和酰胺II帶（1 600～1 500 cm-1）的紅外吸收光譜研究蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，酰胺I帶的特征振動(dòng)取決于C＝O與N—H之間的氫鍵性質(zhì)，酰胺II帶主要是由C—N伸縮振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)產(chǎn)生的[19]。與紅豆蛋白相比，無論是否經(jīng)過超聲處理，紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的酰胺I帶和酰胺II帶的紅外吸收強(qiáng)度都出現(xiàn)增加，這表明葉黃素分子中的氧原子、羥基與蛋白分子中C＝O、C—N基團(tuán)可能通過疏水作用力等結(jié)合[20]，說明葉黃素使紅豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定程度的改變。

圖3 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的FTIR光譜Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of red bean protein-lutein complexes

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量關(guān)系與其酰胺I帶的光譜吸收密切相關(guān)，通過Peakfit 4.12軟件擬合得到紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，結(jié)果見表3。對(duì)照組與紅豆蛋白相比，α-螺旋相對(duì)含量降低4.78%，β-折疊相對(duì)含量降低7.02%，無規(guī)卷曲相對(duì)含量增加17.93%，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量沒有顯著變化（P＞0.05），這說明紅豆蛋白與葉黃素結(jié)合后，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變得無序，花青素與大豆分離蛋白的相互作用也是類似結(jié)果[4]。不同超聲處理?xiàng)l件對(duì)紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有不同影響。在低功率和短時(shí)間（處理1）的超聲處理下，與對(duì)照組相比，復(fù)合物的α-螺旋相對(duì)含量減少，無規(guī)卷曲相對(duì)含量增加，而β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量均沒有顯著變化（P＞0.05），這說明低功率和短時(shí)間的超聲處理能夠使復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲，這種轉(zhuǎn)變?cè)?40 W超聲處理10 min（處理5）時(shí)效果最明顯。α-螺旋是通過肽鏈的內(nèi)部氫鍵穩(wěn)定，而β-折疊通過肽鍵之間的氫鍵而穩(wěn)定，由于超聲處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開，氫鍵被削弱，從而使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得無序和靈活[21]，這也可能是超聲能夠促進(jìn)紅豆蛋白與葉黃素結(jié)合的原因，進(jìn)而利于蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的發(fā)揮[22]。然而，隨著超聲處理的不斷進(jìn)行，在高功率和長時(shí)間的超聲處理下，復(fù)合物的α-螺旋和β-折疊相對(duì)含量降低，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量開始增加，而無規(guī)卷曲相對(duì)含量變化不顯著（P＞0.05），這說明高功率和長時(shí)間的超聲處理可能不利于α-螺旋結(jié)構(gòu)向無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，而是轉(zhuǎn)變成另一種有序的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。然而，Hu Hao等[7]在對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行超聲波處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，高功率（400 W和600 W）、長時(shí)間（30 min）超聲處理可以增加α-螺旋相對(duì)含量，減少β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對(duì)含量，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果矛盾，這可能是超聲條件、溶劑環(huán)境、蛋白質(zhì)類型等不同導(dǎo)致的。

表3 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 3 Secondary structure contents of red bean protein-lutein complexes

2.4 不同超聲處理下紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的表面疏水性

圖4 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的表面疏水性Fig. 4 Surface hydrophobicity of red bean protein-lutein complexes

蛋白質(zhì)表面疏水性是表征與極性水環(huán)境接觸的蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)數(shù)目的指標(biāo)，并且與其乳化性質(zhì)密切相關(guān)。由圖4可知，葉黃素與紅豆蛋白的結(jié)合使蛋白質(zhì)表面疏水性顯著下降（P＜0.05），這可能是由于葉黃素與蛋白質(zhì)通過疏水鍵結(jié)合，這一現(xiàn)象與對(duì)姜黃素-大豆分離蛋白復(fù)合物的研究結(jié)果[5]一致。經(jīng)超聲處理后的復(fù)合物表面疏水性顯著升高（P＜0.05），且高于紅豆蛋白，這表明超聲處理對(duì)紅豆蛋白表面疏水性的增加作用大于葉黃素對(duì)表面疏水性的降低作用。對(duì)β-伴大豆球蛋白[23]和黑豆蛋白[24]進(jìn)行超聲處理時(shí)，也觀察到類似現(xiàn)象。隨著超聲功率增加和超聲時(shí)間的延長，表面疏水性呈先升高后降低的趨勢，在240 W超聲處理10 min（處理5）時(shí)，復(fù)合物的表面疏水性達(dá)到最大。這表明適當(dāng)?shù)某曁幚碚T導(dǎo)蛋白質(zhì)分子發(fā)生一定程度的解折疊，從而導(dǎo)致最初在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)和區(qū)域暴露于極性環(huán)境的數(shù)量增加；當(dāng)超聲處理過度時(shí)，蛋白顆粒之間通過靜電等非共價(jià)作用發(fā)生聚集，導(dǎo)致部分疏水基團(tuán)又被重新包埋。

2.5 不同超聲處理下紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的巰基含量

圖5 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的巰基含量Fig. 5 Sulfhydryl contents of red bean protein-lutein complexes

含有巰基的功能蛋白主要是通過巰基與二硫鍵的相互轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)其功能的。游離巰基對(duì)于維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)有重要作用，可參與次級(jí)鍵的形成，其含量能夠反映蛋白質(zhì)的變性程度，但是極容易被氧化成二硫鍵。由圖5可知，葉黃素的結(jié)合使紅豆蛋白游離巰基含量顯著下降（P＜0.05），這可能是由于蛋白質(zhì)與葉黃素中羥基基團(tuán)發(fā)生相互作用，導(dǎo)致巰基含量的下降，Sui Xiaonan等[4]在花青素-大豆蛋白復(fù)合物的研究中也觀察到類似的現(xiàn)象。超聲處理可使紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的游離巰基含量顯著升高（P＜0.05），這可能是由于超聲處理改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，破壞了蛋白質(zhì)分子之間的一些二硫鍵，形成新的游離巰基[25]。與未經(jīng)超聲處理的復(fù)合物相比，在較短超聲時(shí)間（5 min）處理時(shí)，復(fù)合物的游離巰基含量增加，且隨超聲功率增加而增加，但低于紅豆蛋白的游離巰基含量。當(dāng)超聲條件達(dá)到240 W處理10 min（處理5）以后，復(fù)合物的游離巰基含量高于紅豆蛋白，這表明適當(dāng)?shù)某曁幚砟軌蛴行б种迫~黃素對(duì)紅豆蛋白游離巰基的降低作用，甚至改善其游離巰基的暴露。然而，在較高超聲功率（360 W）和較長超聲時(shí)間（20 min）處理時(shí)，復(fù)合物的游離巰基含量相較于處理5、6、7、8組而言又有一定程度的降低，這可能是長時(shí)間高功率的處理使游離出來的巰基被氧化導(dǎo)致的[26]。對(duì)于總巰基含量，經(jīng)不同超聲處理后，其變化并沒有明顯的趨勢，這一現(xiàn)象與Jambrak等[27]的研究結(jié)果一致。

2.6 不同超聲處理下紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的溶解度

蛋白質(zhì)與水之間的作用力主要是蛋白質(zhì)中的肽鍵（偶極-偶極相互作用或氫鍵），或氨基酸的側(cè)鏈（解離的、極性甚至非極性基團(tuán)）同水分子之間發(fā)生了相互作用，蛋白質(zhì)變性的程度也可以通過蛋白質(zhì)溶解度評(píng)價(jià)。由圖6可知，與葉黃素的結(jié)合能夠顯著提高紅豆蛋白的溶解度（P＜0.05），其原因可能歸結(jié)于葉黃素與蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)作用使蛋白的表面疏水性下降（圖4）。與對(duì)照組相比，所有經(jīng)超聲處理的紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的溶解度均顯著增加（P＜0.05）。從整體上看，隨著超聲時(shí)間延長及超聲功率的增加，紅豆蛋白的溶解度呈先增加后減小的趨勢，當(dāng)超聲條件為240 W處理20 min（處理5）時(shí)，復(fù)合物的溶解度達(dá)到最大值（71.48%），這可能與復(fù)合物具有較高的結(jié)合率有關(guān)。這意味著適當(dāng)?shù)某曁幚砜蛇M(jìn)一步提高蛋白質(zhì)-葉黃素復(fù)合物的溶解度。一方面，超聲的空化作用能夠破壞蛋白質(zhì)內(nèi)部的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子展開，分子體積減小，與水的相互接觸面積增大，從而導(dǎo)致溶解度的增加[7]；另一方面，超聲處理使蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性，強(qiáng)化了蛋白質(zhì)與水的相互作用，因此復(fù)合物的溶解度有所提高。然而，過度超聲處理會(huì)使將蛋白質(zhì)分子聚集在一起的一些物理作用力遭到高強(qiáng)度超聲的破壞，釋放出不溶性蛋白質(zhì)聚集體，導(dǎo)致溶解度降低[28]。

2.7 不同超聲處理下紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的乳化性及乳化穩(wěn)定性

圖7 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的乳化性及乳化穩(wěn)定性Fig. 7 Emulsifying capacity and emulsion stability of red bean protein-lutein complexes

由圖7可知，與未處理的紅豆蛋白相比，紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性均有所增加，但是變化不顯著（P＞0.05）。蛋白質(zhì)乳化作用與其溶解度和表面疏水性均有關(guān)，雖然與葉黃素的結(jié)合使紅豆蛋白的溶解度增加，但會(huì)降低其表面疏水性，這可能是導(dǎo)致其乳化性沒有顯著變化的原因。與對(duì)照組相比，超聲處理會(huì)顯著提高復(fù)合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性（P＜0.05）。隨著超聲功率的增加和超聲時(shí)間的延長，乳化性先增加后減小。在較低功率（120 W）或較短時(shí)間（5 min）的超聲處理下，復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性隨超聲處理時(shí)間延長或超聲功率增加呈增加趨勢；而在高功率（360 W）和長時(shí)間（20 min）的超聲處理下，復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性與360 W、10 min和240 W、20 min處理組相比出現(xiàn)了顯著降低（P＜0.05）。當(dāng)超聲條件為240 W處理10 min（處理5）時(shí)，乳化性和乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大，這與此超聲條件下復(fù)合物具有最高的溶解度和表面疏水性有關(guān)。適當(dāng)?shù)某暪β剩?40 W）和處理時(shí)間（10 min）能夠使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分散，蛋白質(zhì)發(fā)生適度變性，有效暴露出疏水基團(tuán)，同時(shí)增強(qiáng)其溶解度，促進(jìn)了蛋白質(zhì)與葉黃素的相互作用，從而使乳化性和乳化穩(wěn)定性提高[29]。此外，此超聲條件下復(fù)合物的結(jié)構(gòu)更加松散、熱穩(wěn)定性更低，二級(jí)結(jié)構(gòu)更加無序和靈活，這也可能是導(dǎo)致乳化作用增強(qiáng)的原因。然而，高功率（360 W）和長時(shí)間（20 min）的超聲處理會(huì)使蛋白質(zhì)嚴(yán)重變性，產(chǎn)生較多的不溶性蛋白[30]。同時(shí)，過度超聲處理使復(fù)合物中蛋白質(zhì)分子重新聚集，使其結(jié)構(gòu)更加緊密和有序，導(dǎo)致其乳化作用降低，與DSC和FTIR分析結(jié)果符合。研究證明不同超聲處理對(duì)大豆蛋白在油-水界面的結(jié)構(gòu)重排分散產(chǎn)生不同的影響，從而表現(xiàn)出不同的乳化性和乳化穩(wěn)定性[27]。

2.8 起泡性及泡沫穩(wěn)定性分析

圖8 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的起泡性及泡沫穩(wěn)定性Fig. 8 Foaming capacity and foam stability of red bean protein-lutein complexes

由圖8可知，與未處理的紅豆蛋白相比，與葉黃素的結(jié)合不會(huì)使蛋白質(zhì)的起泡性發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。然而，超聲處理可以顯著提高紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的起泡性。隨超聲時(shí)間延長或超聲功率增加，在較低功率（120 W）或較短時(shí)間（5 min）的超聲處理下復(fù)合物的起泡性呈增加趨勢；而在較長時(shí)間（20 min）時(shí)，復(fù)合物的起泡性又顯著降低（P＜0.05），同時(shí)在功率240W、10 min處理下起泡性最大，這說明適當(dāng)?shù)某曁幚砟軌蛴行Ц纳茝?fù)合物的起泡性。這可能是由于超聲作用使蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，在提高表面疏水性的同時(shí)降低了氣-水界面的表面張力[31]。畢爽等[32]研究指出蛋白質(zhì)經(jīng)超聲處理解聚成小分子亞基，增加了氣-水界面的蛋白分子數(shù)目，導(dǎo)致起泡能力提高。而高功率和長時(shí)間的超聲作用使復(fù)合物中蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，導(dǎo)致其起泡性的降低。此外，復(fù)合物起泡性的變化也可能與超聲作用引起其結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，這在本實(shí)驗(yàn)熱穩(wěn)定性和二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析中可以得到證明。紅豆蛋白與葉黃素形成復(fù)合物后泡沫穩(wěn)定性沒有顯著變化（P＞0.05），且超聲處理也不會(huì)明顯改善復(fù)合物的泡沫穩(wěn)定性，這與大豆蛋白[13]和蛋清蛋白[25]經(jīng)超聲處理的研究結(jié)果一致。然而，Tan等[33]指出隨著超聲功率增加和超聲時(shí)間的延長，乳清蛋白泡沫穩(wěn)定性增加，產(chǎn)生這種差異的原因可能與蛋白質(zhì)種類和濃度、分子結(jié)構(gòu)、親水/疏水能力以及超聲處理?xiàng)l件等因素有關(guān)。

3 結(jié) 論

超聲處理能夠促進(jìn)紅豆蛋白與葉黃素的結(jié)合，在240 W超聲處理10 min時(shí)，結(jié)合率達(dá)到最大（91.82%）。熱特性分析表明紅豆蛋白與葉黃素形成了復(fù)合物，復(fù)合物的形成使峰值溫度（Tp）和熱焓值（ΔH）降低，超聲處理會(huì)使復(fù)合物的Tp和ΔH進(jìn)一步下降，結(jié)構(gòu)變得松散。適當(dāng)?shù)某曁幚頃?huì)使復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，無序化增加導(dǎo)致表面疏水性和游離巰基含量升高。功能性質(zhì)分析表明與葉黃素的結(jié)合增加了紅豆蛋白的溶解度，而復(fù)合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性以及起泡性和泡沫穩(wěn)定性沒有顯著改變。超聲處理進(jìn)一步改善了復(fù)合物的功能性質(zhì)，在240 W超聲處理10 min時(shí)，復(fù)合物的溶解度、乳化性、乳化穩(wěn)定性和起泡性達(dá)到最大。然而超聲處理并未對(duì)復(fù)合物的泡沫穩(wěn)定性產(chǎn)生明顯影響。這些功能性質(zhì)的改善可能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變的松散和無序化程度增加有關(guān)。