楊 镕，徐安琪，朱煜康，賈 茹，黃 濤，徐大倫，張進杰，楊文鴿*

（寧波大學食品與藥學學院，浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室，浙江 寧波 315211）

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）廣泛存在于魚類中，其主要作用是催化肌原纖維蛋白中谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基與賴氨酸殘基的?-氨基發(fā)生交聯(lián)作用，生成分子內(nèi)或分子間?-(γ-Glu)-Lys非二硫共價鍵，促進蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成[1-2]。熱誘導魚糜凝膠的形成包括凝膠化、凝膠劣化與凝膠熟化3 個階段，研究認為魚肉蛋白的凝膠化有賴于其內(nèi)源性TGase介導的蛋白質(zhì)非二硫共價鍵的交聯(lián)，形成的魚糜凝膠強度與TGase活力正相關(guān)[3-4]。Tsukamasa等[5]指出沙丁魚魚糜較高的凝膠強度與其內(nèi)源性TGase活性較高、可以更好地促進蛋白發(fā)生交聯(lián)有關(guān)；Benjakul等[6-7]發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性TGase能誘導蛋白質(zhì)交聯(lián)，在兩種大眼鯛魚糜的凝膠增強中起重要作用，而幾種TGase的激活劑和抑制劑對4 種熱帶魚類（大眼魚、梭魚、鰭鯛和大眼鯛）魚糜的非二硫鍵共價交聯(lián)及其凝膠形成能力產(chǎn)生影響。可見魚糜含有內(nèi)源性TGase，其活性與魚糜凝膠品質(zhì)密切相關(guān)。

電子束輻照是一種新型的食品加工技術(shù)，在食品保鮮、質(zhì)量和安全控制、品質(zhì)改進等領(lǐng)域應用廣泛，電子束輻照能引起蛋白構(gòu)象的改變，導致蛋白變性、聚集或凝膠化，同時也能改變魚糜內(nèi)源性酶的結(jié)構(gòu)及其活性，從而影響魚糜凝膠的形成[8-9]。如Deng Siyao等[10]利用電子束輻照處理梅魚魚糜，發(fā)現(xiàn)5 kGy劑量可以顯著提高魚糜凝膠強度，這可能與輻照引起魚肉肌原纖維蛋白α-螺旋含量的下降有關(guān)；Malik等[11]研究發(fā)現(xiàn)輻照作用于向日葵蛋白，引起蛋白α-螺旋含量降低和β-折疊含量增加；顧可飛[12]發(fā)現(xiàn)電子束輻照能抑制液態(tài)多酚氧化酶的活性；羅華彬等[13]認為電子束輻照通過影響帶魚魚糜肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶L的二級結(jié)構(gòu)，抑制這兩種內(nèi)源性蛋白酶活性，減輕對肌原纖維蛋白的降解作用，從而起到防止凝膠劣化、有利于形成高品質(zhì)帶魚魚糜凝膠的作用。

帶魚魚糜所含內(nèi)源性TGase也與帶魚魚糜凝膠化作用有關(guān)[14]。為進一步闡述電子束輻照對魚糜凝膠特性的影響機理，本實驗以0～9 kGy電子束輻照帶魚魚糜，提取魚糜中的內(nèi)源性TGase，測定酶活力及其最適反應溫度和pH值，并通過傅里葉變換紅外光譜、圓二色光譜分析酶的二級結(jié)構(gòu)，探究電子束輻照對帶魚魚糜TGase的影響機理，旨在為利用電子束輻照改進魚糜及其制品品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍帶魚魚糜購自寧波飛日水產(chǎn)實業(yè)有限公司，-20 ℃貯藏備用。

DL-二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、單丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC） 美國Sigma公司；N,N-二甲基化酪蛋白 北京索萊寶公司；其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NBL-1020電子直線加速器 寧波超能科技股份有限公司；UMC 5型真空斬拌機 德國Stephan Machinery公司；Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機 德國Thermo Scientific SORVALL公司；SpectraMax i3多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；J-1500圓二色光譜儀 日本JASCO公司；FWT-60薄膜劑量計 美國遠西公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜輻照處理

冷凍帶魚魚糜，300 g/袋真空包裝。設(shè)置電子直線加速器能量為10 MeV，輻照劑量分別為0、1、3、5、7、9 kGy，采用FWT-60薄膜劑量計，通過分光光度法標定吸收劑量，該劑量計經(jīng)中國計量科學院比對，劑量誤差小于±3%，其中以0 kGy為對照組。輻照時樣品整齊排列，設(shè)置3 個平行；輻照后冰藏保存樣品，并在2 h內(nèi)進行TGase的提取和魚糜凝膠的制作。

1.3.2 TGase的提取及其活力的測定

TGase的提取及其活力的測定參照楊方[15]、Takagi[16]等的方法略作修改。取各組魚糜5 g，加入預冷的Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L pH 7.5、含10 mmol/L NaCl）15 mL，冰浴中緩慢攪拌30 min后離心（16 000×g、4 ℃、30 min），上清液用硫酸銨沉淀，冷凍離心10 min，沉淀用Tris-HCl緩沖液溶解，即為TGase酶液。將酶液放入透析袋中過夜，純化后冷凍干燥。

將凍干TGase粉末溶于蒸餾水中，制成TGase酶液。取2 mL酶液，加入2 mL反應液（含2 mg/mL N,N-二甲基化酪蛋白、5 mmol/L CaCl2、30 μmol/L MDC、3 mmol/L DTT、50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），37 ℃下反應10 min，加入1 mol/L (NH4)2SO4溶液終止反應。酶標儀測定熒光強度，激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為480 nm，以每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物所需要的酶量為1 個活力單位（U）。

1.3.3 TGase最適反應溫度與最適反應pH值的測定

將反應體系溫度分別設(shè)置為0、25、35、40、45、55、65、75、85 ℃，其余按照1.3.2節(jié)方法測定TGase活力，確定輻照對TGase最適反應溫度的影響。將反應體系分別設(shè)置為不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0）的Tris緩沖液，其余按照1.3.2節(jié)方法測定TGase活力，確定輻照對TGase最適反應pH值的影響。

1.3.4 TGase的傅里葉變換紅外光譜分析

準確稱取干燥TGase樣品1.0 mg，與溴化鉀粉末以質(zhì)量比1∶100混合均勻，壓片掃描（400～4 000 cm-1），采用Peakfit 4.12軟件計算TGase中各二級結(jié)構(gòu)單元的相對含量。

1.3.5 TGase的圓二色光譜分析

參照Guan Aiyan等[8]的方法略作修改。采用圓二色光譜儀，選用光徑為1 mm的石英樣品池，在遠紫外區(qū)（190～250 nm）對0.2 mg/mL TGase溶液進行掃描，掃描速率為50 nm/min，響應時間0.25 s，以蒸餾水作空白。利用儀器自帶軟件楊氏模量程序計算各二級結(jié)構(gòu)的相對含量。

1.3.6 魚糜凝膠強度和保水性的測定

樣品處理及凝膠強度測定參考鄧思瑤等[17]的方法。取各組帶魚魚糜，置于真空斬拌機中低溫空斬2 min，添加魚糜質(zhì)量2.5%的食鹽繼續(xù)斬拌8 min。將斬拌后的魚糜溶膠灌入直徑2.5 cm、長約10 cm的腸衣，兩頭扎緊腸衣，再進行二段式加熱凝膠化（40 ℃加熱60 min后90 ℃高溫凝膠化30 min），冷卻得到魚糜凝膠，4 ℃放置12 h后進行凝膠強度和保水性分析。

將魚糜凝膠樣品切割為表面光滑、長度約2 cm的柱體備用。壓縮模式測凝膠強度（P0.5 s探頭），測前、測試、測后速率均為1.0 mm/s，壓縮比50%、10 g觸發(fā)力。

保水性參照文獻[18]方法測定。取待測凝膠樣品，切片（厚度0.2 cm）四等分，雙層濾紙包裹離心（3 000×g，10 min）。記離心管質(zhì)量為m/g，離心前后離心管與樣品總質(zhì)量分別為m1/g和m2/g，按下式計算保水性。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗設(shè)置3～6 個平行，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示，采用Origin 9.0軟件作圖，通過SPSS 19.0軟件方差分析法進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束輻照對帶魚魚糜TGase活力的影響

圖1 電子束輻照對TGase活力的影響Fig. 1 Effect of EB irradiation on the activity of TGase

TGase有促進蛋白形成凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、增強魚糜凝膠的硬度和彈性等作用，較高的TGase活性有利于魚糜凝膠的形成。由圖1可知，隨著輻照劑量的增加，魚糜內(nèi)源性TGase活力先上升后下降，5 kGy組魚糜中的TGase活力最高，并顯著高于對照組及其他劑量處理組（P＜0.05），7 kGy和9 kGy組TGase活力低于對照組，尤其是9 kGy組TGase活力顯著降低。羅華彬等[13]發(fā)現(xiàn)電子束輻照處理會降低帶魚魚糜蛋白酶的活性，隨著輻照劑量的增加，內(nèi)源性蛋白酶活性降低，當劑量為5 kGy及以上時下降程度更為顯著；顧可飛[12]發(fā)現(xiàn)當電子束輻照劑量為8.69 kGy時，液態(tài)多酚氧化酶的相對活力損失85%；趙菊鵬[19]發(fā)現(xiàn)不同劑量輻照桔小實蠅各齡幼蟲后，均不同程度誘導了羧酸酯酶的活性升高；鄭秀艷等[20]認為0.75～4.50 kGy輻照不會對脂肪氧化酶活性產(chǎn)生明顯影響；戴群等[21]對茶葉分別進行4、7、10 kGy和12 kGy輻照，發(fā)現(xiàn)4 kGy組過氧化物酶活力及4 、7 kGy和10 kGy組多酚氧化酶活力均高于對照組?？梢姡椪諏γ富钚缘挠绊懪c劑量及酶的種類有關(guān)，不同酶對輻照的敏感性不一。本實驗中，1、3 kGy和5 kGy劑量能激活TGase活性，其中5 kGy組效果最顯著，但7 kGy和9 kGy劑量則抑制TGase活性。原因在于輻照有可能影響蛋白結(jié)構(gòu)，也能改變魚糜內(nèi)源酶的空間構(gòu)象。推測較低劑量輻照能促進TGase肽鏈的伸展，活性基團的適當暴露有利于酶催化肌原纖維蛋白中谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基與賴氨酸殘基的?-氨基發(fā)生交聯(lián)，而隨著輻照劑量的繼續(xù)增加，TGase分子上暴露基團之間的相互作用增強，從而削弱了酶分子對底物的親和能力，導致酶活力下降。

2.2 電子束輻照對帶魚魚糜TGase最適反應溫度和pH值的影響

由表1可知，9 kGy組魚糜TGase的最適反應溫度為45 ℃，其余組均為40 ℃。在55～75 ℃區(qū)間內(nèi)，各組魚糜TGase活力有所降低，而在85 ℃時TGase活力急劇下降。電子束輻照后魚糜內(nèi)源性TGase對溫度的敏感性不同，25 ℃時對照組魚糜TGase活力最大，35 ℃和40 ℃時，1、3、5 kGy組魚糜TGase活力高于對照組，而在45 ℃條件下，對照組和5、7 kGy組魚糜TGase活力基本接近，并高于其余組。

表1 電子束輻照對不同溫度下TGase活力的影響Table 1 Effect of EB irradiation on the activity of TGase at different temperatures U/g

表2 電子束輻照對不同pH值下TGase活力的影響Table 2 Effect of EB irradiation on the activity of TGase at different pH levels U/g

由表2可以得出，各組帶魚魚糜內(nèi)源性TGase的最適反應pH值在8.0左右，輻照處理沒有改變TGase的最適反應pH值。魚的種類及其生活的環(huán)境溫度會影響魚類內(nèi)源性TGase的最適反應溫度和最適反應pH值。Worratao等[22]從羅非魚魚肉中分離得到TGase，測定其最適反應溫度為50 ℃，鳙魚內(nèi)源性TGase的最適反應溫度約為40 ℃[23]，羅非魚和鳙魚TGase的最適反應pH值均為7.0～7.5，而紅金線魚、長尾大眼鯛、真鯛魚TGase的最適反應pH值分別為8.5～9.0、8.0、9.0～9.5[24-26]。本實驗中帶魚魚糜TGase的最適反應溫度和pH值與其他魚種也基本吻合。嚴菁[27]研究了TGase作用于鰱魚魚糜的最適反應溫度，認為在37 ℃時TGase具有較高的活力；孫靜靜[28]在TGase對草魚糜凝膠性的影響研究中認為，溫度保持在42 ℃有利于提高TGase活力，形成品質(zhì)更好的魚糜凝膠。

和大多數(shù)酶一樣，pH值會影響酶分子上基團的解離，影響酶和底物分子的結(jié)合；高溫下酶和底物分子運動加快，碰撞機會增加，進而提高酶的催化活性，但高溫同時會引起酶分子變性失活。經(jīng)電子束輻照處理，各組魚糜內(nèi)源性TGase的活力隨著pH值或溫度的升高呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，并均在pH 8.0、溫度40～45 ℃時活力達到最大，可見輻照處理影響魚糜內(nèi)源性TGase的活性，但并沒有明顯改變TGase的最適反應pH值和最適反應溫度。在熱誘導魚糜凝膠形成的過程中，低溫段采取40 ℃加熱有利于輻照魚糜內(nèi)源性TGase發(fā)揮催化作用，促進魚糜的凝膠化作用。

2.3 電子束輻照對帶魚魚糜TGase二級結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

圖2 TGase的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of TGase

紅外光譜在多個波段對蛋白質(zhì)分子中的化學基團具有特征吸收帶，可以反映蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)信息[29-31]。由圖2可知，各組魚糜TGase在紅外區(qū)出現(xiàn)若干個特征吸收峰，其中1 051 cm-1左右處吸收峰代表分子中的C—O伸縮振動；1 515～1 570 cm-1為酰胺II帶的特征吸收區(qū)域，由60%的N—H彎曲振動和40%的C—N伸縮振動引起；1 600～1 700 cm-1為酰胺I帶的吸收峰，譜峰指認比較成熟，其對應關(guān)系分別為β-折疊（1 610～1 639 cm-1）、無規(guī)卷曲（1 640～1 650 cm-1）、α-螺旋（1 651～1 660 cm-1）、β-轉(zhuǎn)角（1 661～1 670 cm-1），酰胺I帶的吸收峰能較好地反映蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；3 300 cm-1左右為酰胺A帶的吸收峰，波數(shù)的變化與酶分子中氫鍵的變化有關(guān)[32]。通常高溫或輻照等處理會破壞分子內(nèi)的氫鍵作用，影響蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)單元，使得峰位遷移。

表3 TGase二級結(jié)構(gòu)相對含量（傅里葉變換紅外光譜）Table 3 Secondary structure fractions of TGase (Fourier transform infrared spectroscopy)

與對照組相比，輻照組魚糜TGase在紅外區(qū)的特征吸收峰發(fā)生不同程度偏移，其中酰胺I帶峰由高波數(shù)（1 654 cm-1）向低波數(shù)（1 649 cm-1）移動，可見電子束輻照改變了魚糜TGase的空間結(jié)構(gòu)，分子中的二級結(jié)構(gòu)單元組成發(fā)生了變化。對酰胺I帶進行高斯曲線擬合分析，根據(jù)積分面積計算TGase二級結(jié)構(gòu)的相對含量，結(jié)果見表3。TGase中α-螺旋和無規(guī)卷曲相對含量最高，β-折疊相對含量最低。結(jié)合圖2，輻照組魚糜TGase酰胺I帶峰由高波數(shù)向低波數(shù)移動，分子中部分α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲、β-折疊等結(jié)構(gòu)，尤其在5 kGy組最為明顯，這與表3中5 kGy組α-螺旋相對含量達最低值（27.11%），無規(guī)卷曲相對含量達最大值（34.18%）相一致。

2.3.2 圓二色光譜分析結(jié)果

圖3 TGase的圓二色光譜圖Fig. 3 Circular dichroism spectra of TGase at different irradiation doses

圖4 TGase的二級結(jié)構(gòu)相對含量（圓二色光譜）Fig. 4 Secondary structure fractions of TGase determined by circular dichroism spectroscopy

不同劑量輻照帶魚魚糜TGase的圓二色光譜結(jié)果見圖3，各二級結(jié)構(gòu)的相對含量見圖4。圓二色光譜與傅里葉變換紅外光譜所表征的TGase二級結(jié)構(gòu)相對含量的變化趨勢一致，具體數(shù)值的差異可能是由于計算方法存在差別。由圖4可知，輻照劑量低于5 kGy時，隨著輻照劑量的增加TGase中α-螺旋相對含量減少，β-折疊和無規(guī)卷曲相對含量增加，超過5 kGy則相反。至5 kGy時TGase二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋相對含量達最小值，而β-折疊及無規(guī)卷曲相對含量達最大值。說明低于5 kGy輻照劑量可以促使α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-折疊和無規(guī)卷曲。

結(jié)合輻照處理對TGase活力的影響，推測輻照導致酶蛋白結(jié)構(gòu)的變化，在一定劑量下，α-螺旋中規(guī)則有序的氫鍵穩(wěn)定性遭到破壞，展開的多肽鏈暴露出更多的基團，在分子重新聚集時部分形成β-折疊，部分轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲，而這種變化有利于酶活性基團的暴露并進一步和底物結(jié)合。Cao Hongwei等[33]將TGase添加到魚糜中，發(fā)現(xiàn)微波加熱20 min時TGase活力及魚糜凝膠強度最大，并認為TGase活性的增加與其α-螺旋含量下降有關(guān)；顧可飛[12]發(fā)現(xiàn)當輻照劑量超過4.83 kGy時，隨著電子束輻照劑量的增加，多酚氧化酶α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量不斷下降，而無規(guī)卷曲含量上升；Herrero等[29]用8 kGy電子束輻射鮭魚肉，發(fā)現(xiàn)魚肉蛋白的α-螺旋比例顯著下降，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲比例增多；Lee等[34]在分析γ射線對肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的影響時，也發(fā)現(xiàn)隨劑量的升高，肌紅蛋白α-螺旋含量降低，無規(guī)卷曲含量升高?？梢?，輻照對大多數(shù)蛋白來說，會破壞其有序的構(gòu)象單元，增加無規(guī)卷曲的含量。

2.4 電子束輻照對帶魚魚糜凝膠強度和保水性的影響

圖5 電子束輻照對帶魚魚糜凝膠強度和保水性的影響Fig. 5 Effect of EB irradiation on gel strength and water-holding capacity of surimi gel

如圖5所示，輻照后魚糜凝膠強度和保水性均顯著高于對照組（P＜0.05），并在5 kGy處理組達到最大值，分別為875 g·cm和94.30%，顯著高于對照組（380 g·cm和82.00%），這與5 kGy劑量處理能顯著提升帶魚魚糜TGase活性相一致。電子束輻照會對帶魚魚糜內(nèi)源性TGase產(chǎn)生影響，提升或降低魚糜凝膠強度，同時輻照也會引起魚糜肌原纖維蛋白、其他內(nèi)源性酶發(fā)生變化，從而影響魚糜凝膠的形成。本實驗室在輻照對魚糜凝膠特性的研究中，也發(fā)現(xiàn)適宜劑量（5～7 kGy）的輻照處理會改變魚糜蛋白分子的交聯(lián)度，使其凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加緊密，同時也能通過抑制魚糜內(nèi)源性肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶L的活性，減輕對肌原纖維蛋白的降解作用，從而起到防止凝膠劣化、增強其凝膠強度和保水性的作用[9,13,17]。電子束輻照對魚糜凝膠強度和保水性等宏觀凝膠特性的影響，是魚糜中肌原纖維蛋白、內(nèi)源性酶等微觀分子結(jié)構(gòu)變化的綜合結(jié)果。

3 結(jié) 論

電子束輻照處理對帶魚魚糜內(nèi)源性TGase的酶學特性產(chǎn)生影響，隨著輻照劑量由1 kGy增加到9 kGy，TGase活力呈現(xiàn)先上升后降低，5 kGy劑量處理能顯著提升魚糜TGase活性，輻照不影響TGase的最適反應pH值，除9 kGy處理組外，各組魚糜TGase的最適反應溫度均為40 ℃。為形成更好的魚糜凝膠，通常采用二段式加熱，低溫段溫度設(shè)置為40 ℃有利于TGase發(fā)揮最適作用；輻照引起魚糜TGase分子中的二級結(jié)構(gòu)單元轉(zhuǎn)變，導致其構(gòu)象變化，適宜劑量電子束輻照能使TGase酶蛋白分子中結(jié)構(gòu)相對緊密的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為較松散的β-折疊及無規(guī)卷曲，有利于TGase活性基團的暴露，有效提高魚糜TGase活性，促進帶魚魚糜凝膠的形成。