李占明，俞 玥，梁 奕，田 磊，戴 煌，徐 磊，周冬仁,*，毛 豪

（1.江蘇科技大學糧食學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212004；2.福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108；3.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；4.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州 313001）

膳食天然抗氧化劑如植物黃酮類化合物可以有效緩解氧化應(yīng)激，抑制多種疾病的發(fā)生及發(fā)展，提高人體健康水平[1]。開展天然植物抗氧化劑的相關(guān)研究具有良好的實際應(yīng)用價值，并有助于擴充植物功能成分的相關(guān)營養(yǎng)學知識[2-3]。然而，由于黃酮化合物的生物可及性較低，限制了其生物活性的發(fā)揮[4]。黃酮類化合物的低穩(wěn)定性和非靶向釋放也與黃酮化合物活性的降低有關(guān)[5]。因此，提高植物黃酮類化合物在胃腸消化過程中的生物可及性是提高其健康效益的關(guān)鍵[6]。

在胃腸道消化中，不同消化階段的pH值變化較大，減弱胃腸道消化過程中的竹葉黃酮降解對提高生物可及性具有重要意義[7-8]。含有黃酮類化合物的食物到達小腸，然后進入血液。一般來說，同時食用含有其他食物基質(zhì)和黃酮類化合物的食物有助于提高黃酮化合物的生物可及性，抵消體內(nèi)不同消化階段pH值的變化對黃酮化合物的降解[9]。研究發(fā)現(xiàn)，食品中的淀粉和纖維素產(chǎn)生的物理空隙限制了消化液和黃酮混合過程，有效降低了黃酮類化合物的降解，有助于更多的黃酮化合物到達腸壁，進而被吸收或者代謝[10-12]。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，水溶性的膳食纖維素黃原膠有助于提高模擬消化過程中4 種竹葉黃酮的生物可及性[13]。然而，果膠對黃酮類化合物保護作用的相關(guān)研究鮮見報道，需要進一步深入探索。

體外模擬胃腸消化模型因可提供篩選食物成分的機會、研究期限短、研究成本低，并可以避免使用動物模型而引起的倫理問題，從而得到了廣泛的關(guān)注[14-16]?，F(xiàn)有研究表明，體外胃腸消化模型已被廣泛應(yīng)用于食品或藥品的模擬消化過程，并應(yīng)用于分析不同處理對目標化合物的活性影響和活性分子生物可及性的相關(guān)研究中[17-18]。

近年來，竹葉黃酮化合物因具有抗氧化、抗炎、抗心血管疾病等良好的生物活性而受到廣泛關(guān)注[19]。據(jù)報道，提取自竹葉中的竹葉黃酮類化合物的特征性成分為葒草苷、異葒草苷、牡荊素和異牡荊素[20-21]，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 4 種竹葉黃酮的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of isoorientin, orientin, isovitexin and vitexin from bamboo leaves

目前相關(guān)研究主要集中在黃酮類化合物的抗氧化活性等方面[22-23]。然而，鮮有研究闡明胃腸道消化過程對竹葉黃酮生物可及性的影響[13]，而良好的生物可及性是竹葉黃酮發(fā)揮其生物活性的基礎(chǔ)。前期研究發(fā)現(xiàn)，在模擬腸道消化時，添加果膠可顯著提升竹葉提取物中竹葉黃酮的生物可及性。因此，本研究采用體外模擬胃腸消化模型測定竹葉黃酮化合物的生物可及性，結(jié)合超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）儀分析闡明果膠對竹葉黃酮提取物中4 種特征性成分體外模擬胃腸消化過程中的保護作用。實驗中，采用主成分分析和聚類分析相結(jié)合的方法，研究了4 種黃酮類化合物在體外模擬胃腸消化過程中的變化，相關(guān)研究有助于闡明體外消化過程中竹葉黃酮生物可及性的變化，對竹葉黃酮類功能食品的開發(fā)具有良好的促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹葉 浙江圣氏生物有限公司；果膠、福林-酚試劑、α-淀粉酶 美國西格瑪奧德里奇試劑公司；胃蛋白酶、胰酶、膽酸鈉 上海阿拉丁生化試劑公司；葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素等化合物的標準品由實驗室自行制備（純度＞97%）。其他試劑為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

Bioteck離心機、多功能酶標儀 美國貝克曼庫爾特有限公司；ACQUITY UPLC柱分析系統(tǒng) 美國沃特世科技公司；漩渦混勻儀 德國IKA公司；機械攪拌器 上海滬析實業(yè)有限公司；掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

樣品制備參照文獻[13]并略作修改，簡述如下：采用實驗室用小型磨粉機磨碎竹葉（Pleioblastus kongosanensis f. aureostriatus）樣品后，按照料液比1∶10（m/m）加入蒸餾水后，進行機械攪拌，室溫攪拌過夜，提取竹葉黃酮。提取所得的混合物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進行冷凍干燥，收集固體粉末（竹葉黃酮提取物）用于后續(xù)實驗。添加果膠組樣品制備過程如下：竹葉黃酮提取物經(jīng)水溶解后，與制備好的果膠溶液混合（竹葉黃酮提取物終質(zhì)量濃度10 mg/mL、果膠終濃度質(zhì)量濃度8 mg/mL），漩渦混勻后4 ℃避光過夜。以直接消化組的樣品（不添加果膠，竹葉黃酮提取物終質(zhì)量濃度10 mg/mL）作為對照。測定竹葉黃酮提取物總酚、總黃酮含量。

1.3.2 總酚含量測定

采用福林-酚法測定竹葉黃酮提取物的總酚含量[24]。將不同體積（0、30、60、90、120、150 μL）的0.1 mg/mL沒食子酸工作溶液加入離心管后，加入40 μL福林-酚試劑，再加入100 μL、質(zhì)量分數(shù)10%碳酸鈉溶液。用去離子水將反應(yīng)體系定容至1 mL，反應(yīng)90 min后，采用酶標儀在765 nm波長處測定吸光度，制作標準曲線，依據(jù)標準曲線計算總酚含量，結(jié)果以每克干物質(zhì)中沒食子酸質(zhì)量表示，單位為mg/g。

1.3.3 總黃酮含量測定

總黃酮含量的測定參考文獻[25]的方法，以兒茶素為標準品，依據(jù)標準曲線計算，結(jié)果以每克干物質(zhì)中兒茶素質(zhì)量表示，單位為mg/g。

1.3.4 體外消化模型的建立

體外模擬胃腸道消化參考González-Montoya等[26]的方法并略作修改。取18 mL竹葉黃酮提取物溶液（含果膠或不含果膠），加入2 mL α-淀粉酶，以形成模擬口腔消化液（pH 7.0），漩渦后37 ℃孵育10 min后，用鹽酸溶液（1 mol/L）調(diào)整pH值到2.0±0.1，同時取4 個樣（每個樣體積為400 μL）作為口腔消化后的樣品（記為A10），將收集好的A10樣品的pH值調(diào)整到7.0±0.1后進行相關(guān)指標的測定。然后，取1 mL的胃蛋白酶（10 mg/mL）加入到取樣后剩余的A10樣品溶液中，37 ℃孵育 90 min，再將溶液的pH值調(diào)整到7.0±0.1后進行取樣，得到模擬胃消化后的樣品B90（取4 個樣，每個400 μL）。在取樣后剩余的B90樣品中加入2.5 mL的胰酶（8 mg/mL）和2.5 mL膽酸鹽溶液（50 mg/mL）中形成模擬腸道消化液，37 ℃孵育 90 min后，在95 ℃水浴加熱10 min終止反應(yīng)，得到模擬腸道消化后的樣品C90（取樣4 個，每個400 μL）。取樣結(jié)束后，所有樣品經(jīng)冷凍干燥，干燥后的粉末貯藏在-20 ℃以備后續(xù)分析。

經(jīng)體外模擬消化的3 個階段（口腔、胃、腸）后，直接消化組的樣品分別記為dA10、dB90、dC90，添加果膠后消化的樣品記為pA10、pB90、pC90，原始樣品未經(jīng)體外模擬消化處理的樣品記為O。

1.3.5 竹葉黃酮質(zhì)量濃度和生物可及性的測定

采用UPLC測定10 mg/mL竹葉黃酮提取物消化前后及果膠添加組消化后的竹葉黃酮（異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、牡荊素）質(zhì)量濃度。將不同消化階段的樣品溶解在1 mL甲醇中，漩渦充分混勻，然后8 000×g離心15 min，取上清液1 μL進行UPLC分析。UPLC分析采用ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相A（乙腈）、流動相B（體積分數(shù)0.1%磷酸溶液）的體積比為82∶18，流速為0.21 mL/min。依據(jù)340 nm波長處的吸光度，經(jīng)由標準曲線計算溶液中4 種竹葉黃酮的質(zhì)量濃度，并計算其生物可及性，生物可及性是模擬消化后樣品中的竹葉黃酮質(zhì)量濃度與原始樣品中竹葉黃酮質(zhì)量濃度的比值[27]。

1.3.6 掃描電子顯微鏡觀察

為了考察添加果膠的效果，將8 mg/mL果膠溶液、10 mg/mL竹葉黃酮提取物溶液、果膠和竹葉黃酮提取物終質(zhì)量濃度分別為8、10 mg/mL的混合溶液按照掃描電子顯微鏡樣品測試要求制備樣品后，觀察其顆粒形貌。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用主成分分析和聚類分析研究不同處理樣品中4 種竹葉黃酮質(zhì)量濃度的聚類趨勢，數(shù)據(jù)差異采用SPSS 19.0軟件的單因素方差分析方法進行比較，P＜0.05時表示差異顯著，采用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚含量及UPLC定量結(jié)果

未經(jīng)消化的竹葉黃酮提取物中總酚含量為（78.834±1.287）mg/g，總黃酮含量為（79.932±2.076）mg/g。4 種竹葉黃酮的UPLC如圖2所示，未經(jīng)消化的10 mg/L竹葉黃酮提取物溶液中異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、牡荊素的質(zhì)量濃度分別為239.251、67.052、58.123、27.04 mg/L。

圖2 4 種竹葉黃酮的UPLC譜圖Fig. 2 UPLC profile of four bamboo flavonoids

2.2 體外模擬消化中各階段不同樣品組的黃酮質(zhì)量濃度

圖3 不同體外模擬消化階段各樣品中4 種竹葉黃酮的質(zhì)量濃度Fig. 3 Concentrations of bamboo leaf flavonoids at different simulated in vitro digestion stages

在各階段不同樣品中的4 種竹葉黃酮化合物中，異葒草苷質(zhì)量濃度最高，其次為葒草苷、異牡荊素、牡荊素。與直接消化樣品和添加果膠的樣品相比，原始樣品中竹葉黃酮的質(zhì)量濃度最高。如圖3所示，與直接消化樣品相比，在3 個階段消化過程中，添加果膠均顯著抑制了4 種竹葉黃酮質(zhì)量濃度的降低（P＜0.05）。經(jīng)口腔消化后，與直接消化組相比，添加果膠組的異葒草苷質(zhì)量濃度顯著提高（從150.4 mg/L提高到207.8 mg/L），葒草苷、異牡荊素和牡荊素的質(zhì)量濃度分別提高了17.7%、41.4%和35.1%（圖3A）。胃模擬消化添加果膠樣品后，與直接消化樣品相比，異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、牡荊素質(zhì)量濃度分別增加25.1%、32.2%、40.9%、56.7%（圖3B）。與直接消化相比，添加果膠可提高腸模擬消化后4 種竹葉黃酮的質(zhì)量濃度（圖3C）。

2.3 不同處理后竹葉黃酮質(zhì)量濃度變化的線性關(guān)系

圖4 4 種竹葉黃酮質(zhì)量濃度變化的線性關(guān)系Fig. 4 Linear relationships between contents of four bamboo leaf flavonoids

為了評價果膠的保護性能，采用多元分析方法揭示不同處理模擬消化階段4 種竹葉黃酮質(zhì)量濃度之進行線性擬合，結(jié)果如圖4所示。4 次重復(fù)的7 種樣品（原始樣品+3 個階段直接消化組樣品+3 個階段果膠添加組樣品）的不同竹葉黃酮質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系。并且，線性相關(guān)性可能與不同竹葉黃酮的結(jié)構(gòu)相似性有關(guān)聯(lián)[27-28]。

2.4 腸道消化后4 種竹葉黃酮的生物可及性及熱圖分析結(jié)果

為了進一步揭示果膠的保護作用，分別對直接消化和添加果膠的兩組樣品中4 種竹葉黃酮在腸道消化后的生物可及性進行研究，結(jié)果如表1所示。添加果膠的樣品與直接消化樣品相比，4 種竹葉黃酮經(jīng)腸道消化后的生物可及性顯著提高，其中異牡荊素和牡荊素的生物可及性分別提高了75.1%和80.2%。比較發(fā)現(xiàn)，相較于葒草苷和異葒草苷，果膠對異牡荊素和牡荊素的生物可及性提升更為明顯。生物可及性的差異可能是黃酮分子結(jié)構(gòu)不同導致的[29]。研究表明，營養(yǎng)物質(zhì)的生物可及性與其結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性[28]。含植物多酚及纖維素的食物基質(zhì)中，植物多酚與纖維之間的相互作用能改變多酚經(jīng)胃腸道消化后的釋放與吸收效率[27]。果膠的添加顯著提高了4 種竹葉黃酮的生物可及性（P＜0.05），使其能夠更多地到達腸壁進而進入循環(huán)系統(tǒng)，從而更好地發(fā)揮其生物活性。本研究中，果膠對提升腸道異牡荊素和牡荊素的生物可及性的效果顯著優(yōu)于異葒草苷和葒草苷。異牡荊素和牡荊素互為同分異構(gòu)體，葒草苷和異葒草苷互為同分異構(gòu)體，這表明竹葉黃酮結(jié)構(gòu)和生物可及性之間的關(guān)聯(lián)性。

表1 模擬腸道消化后4 種竹葉黃酮的生物可及性Table 1 Bioaccessibility of four bamboo leaf flavonoids after stimulated intestinal digestion in the presence and absence of pectin

熱圖分析（圖5）結(jié)果也表明了異牡荊素和牡荊素在同樣處理時其質(zhì)量濃度變化接近，而葒草苷和異葒草苷的質(zhì)量濃度變化接近，兩對同分異構(gòu)體展示了不同的聚類趨勢。Kermani等[30]的研究也表明，不同的聚類趨勢可能由竹葉黃酮的結(jié)構(gòu)差異引起。

圖5 4 種竹葉黃酮的熱圖分析Fig. 5 Heatmap analysis of the concentrations of four bamboo leaf flavonoids at different digestion stages

2.5 主成分分析和聚類分析結(jié)果

圖6 不同處理后樣品中竹葉黃酮質(zhì)量濃度的主成分分析（A）及聚類分析（B）Fig. 6 Principal components analysis plot (A) and cluster analysis plot (B)for the concentrations of four bamboo leaf flavonoids at different digestion stages in the presence and absence of pectin

采用主成分分析法對果膠原始樣品、直接消化組樣品和果膠添加組樣品在消化過程中4 種竹葉黃酮的質(zhì)量濃度進行分析，結(jié)果如圖6A所示，前兩個主成分可以累計貢獻率達到99.41%，可以表征原始數(shù)據(jù)變化的大部分特征信息。不同組別的樣品分布在不同區(qū)域，原始樣品聚為一類，直接消化組聚為一類，果膠添加組聚為一類，說明主成分分析可以很好地反映樣品處理的分類信息。此外，同一組組內(nèi)樣品的分布不同，揭示了不同消化階段產(chǎn)生的效果不同。與直接消化組樣品相比，果膠添加樣品和原始樣品的分布區(qū)域更接近，存在聚類趨勢。此外，在添加果膠的3 個階段的樣品中，pA10樣品與原始樣品較接近，其次是pB90樣品，證實了同一組內(nèi)樣品經(jīng)不同的消化階段處理后存在不同的聚類趨勢。

對樣品進行聚類分析（圖6B），當歐氏距離平方為1.5時，pA10樣本與原始樣本趨于聚類。當歐氏距離平方為1.2時，dA10、dB90和pB90趨于聚類。當歐氏距離平方為0.8時，dC90和pC90樣本趨于聚類。聚類趨勢分析結(jié)果也能表明，模擬腸道消化對竹葉黃酮質(zhì)量濃度的影響大于口腔和胃消化的影響，果膠的加入能提升不同模擬消化階段中竹葉黃酮的質(zhì)量濃度及其生物可及性。

2.6 黃酮生物可及性變化的機制

圖7 果膠分子提升竹葉黃酮分子生物可及性示意圖（A）和不同樣品的掃描電子顯微鏡圖（B）Fig. 7 Schematic diagram illustrating the protective effect of pectin on bamboo leaf flavonoids (A) and corresponding scanning electron microscope images (B)

果膠是一種膳食纖維，包括膠凝（光滑區(qū)域）和非膠凝（粗糙區(qū)域）兩部分，果膠分子的連續(xù)半乳糖酸鹽單位形成兩個鏈之間穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)[31]。半乳糖醛酸和（或）羥基之間的氫鍵有助于鏈締合[32]。因此，果膠復(fù)合物可以成功用于開發(fā)親水生物活性分子的遞送體系[33]。Chen Hua[34]、Jo[35]等研究認為，纖維或淀粉的空腔結(jié)構(gòu)可以用來容納生物活性分子以抑制消化處理造成的活性分子的分解。黃酮分子通過作用于細胞內(nèi)的受體蛋白，發(fā)揮抗炎抗氧化應(yīng)激等生物活性，這種相互作用多通過氫鍵、范德華力、疏水作用力等交聯(lián)，其中氫鍵起著重要作用[36]。本實驗根據(jù)已有研究[31-33]和不同溶液掃描電子顯微鏡圖（圖7B）推斷得到，在果膠溶液中添加竹葉黃酮提取物后，竹葉黃酮可以通過氫鍵及樹枝空間與果膠分子結(jié)合（圖7A），進而果膠顆粒發(fā)揮其對黃酮分子的保護作用[29,37]。果膠的添加有助于增加竹葉黃酮在消化過程中的穩(wěn)定性，從而降低竹葉黃酮在消化液中的消化，提升竹葉黃酮在體外模擬消化過程中的生物可及性，使到達腸壁的竹葉黃酮量增加，進而進入循環(huán)系統(tǒng)，得以發(fā)揮其生物功效。

3 結(jié) 論

通過體外模擬口腔、胃、腸消化并結(jié)合UPLC分析，探究果膠對竹葉提取物中竹葉黃酮化合物的保護作用。結(jié)果表明，果膠提升了竹葉黃酮在體外模擬消化過程中的生物可及性，其中，使腸道消化后異牡荊素和牡荊素生物可及性提高了75.1%和80.2%。采用主成分分析和聚類分析的方法對不同處理的聚類趨勢進行了闡述，證實果膠的加入對竹葉黃酮分子生物可及性有顯著提升。綜上所述，果膠對竹葉黃酮的生物可及性具有增強作用，本研究對于相關(guān)功能性產(chǎn)品的開發(fā)具有良好的理論及應(yīng)用價值。