王蕾 陳旭濤 丁鋒 王悅 宋應(yīng)亮

糖尿病的高血糖毒性，異常胰島素及細胞因子水平、氧化應(yīng)激等，導(dǎo)致了以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征糖尿病性骨質(zhì)疏松的形成[1-2]。同時，糖尿病患者骨折風(fēng)險增加，骨折愈合能力顯著降低[3]，糖尿病患者種植體的早期骨結(jié)合受到影響[4]。近年來，組織工程技術(shù)利用間充質(zhì)干細胞自我更新，多向分化等優(yōu)勢，來提高糖尿病患者的成骨能力。自體干細胞由于臨床易得及無免疫排斥的優(yōu)點，成為理想的種子細胞。其中，BMSCs及ADSCs得到最廣泛的應(yīng)用[5-6]。但對于糖尿病患者，干細胞的生物性能有所改變[7-8]，選擇最適宜的自體干細胞作為糖尿病患者骨再生的種子細胞也成為應(yīng)用熱點。本研究通過比較糖尿病大鼠來源的ADSCs和BMSCs基本生物學(xué)特性，以期為之后的相關(guān)研究提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

MEM Alpha培養(yǎng)基(HyClone，美國)；胎牛血清(BI，以色列)；CCK-8試劑盒(南京恩晶生物科技有限公司)； 油紅O(Sigma，美國)； 堿性磷酸酶(ALP)顯色試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)； 天狼猩紅染色液、茜素紅染色液，結(jié)晶紫染色液(Solaibio?， 北京索萊寶)；總RNA提取試劑盒(TIANGEN?, 天根生化科技(北京)有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(Takara，日本)；細胞孵箱(Thermo，美國)；顯微鏡(OLYMPUS，陜西華大生物公司)。

1.2 糖尿病模型建立

取10只SPF級8周齡SD雄性大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為:糖尿病組(n=6)和正常對照組(n=4)。糖尿病組:高脂高糖飼料喂養(yǎng)4 周后，以30 mg/kg劑量的STZ行腹腔注射。 1 周后尾尖取血，測血糖，以隨機血糖大于16.7 mmol/L為建模成功。正常對照組:普通飼料喂養(yǎng)，并在4 周時行等量檸檬酸緩沖液注射。

1.3 干細胞的分離及培養(yǎng)

ADSCs的分離及培養(yǎng)：選建模成功4 周后的糖尿病大鼠，過量麻藥處死。無菌條件下取腹股溝處的脂肪組織，膠原酶消化法提取ADSCs， 37 ℃、 5% CO2細胞孵箱培養(yǎng)。之后每3 d換液至細胞匯合達80%時傳代。

BMSCs的分離和培養(yǎng)：無菌條件取大鼠雙側(cè)下肢骨。注射器吸取完全培養(yǎng)基，深入骨髓腔內(nèi)反復(fù)沖洗至其內(nèi)發(fā)白，收集細胞懸液，離心重懸后接種， 37 ℃、 5% CO2細胞孵箱培養(yǎng)。之后每3 d換液1 次，至細胞匯合達80%進行傳代。

1.4 細胞克隆及增殖活性檢測

克隆形成率測定：將P3代細胞接種于100 mm培養(yǎng)皿，細胞數(shù)為1 000 個/皿。 10 d后多聚甲醛固定，0.1%的結(jié)晶紫染液染色15 min，顯微鏡下觀察，計數(shù)并拍照。計算細胞克隆形成率。

CCK-8檢測細胞活力：將P3的細胞以5 000/孔的密度接種于96 孔板，每天設(shè)為1 組，每組4 個復(fù)孔，并設(shè)2 個對照孔。每天于同一時間按照10∶1的比例在待測組加入培養(yǎng)基和CCK8混合物110 μl， 37 ℃、 5% CO2的條件下孵育3 h，后吸取懸液100 μl于新的96 孔板， 測450 nm波長處的吸光度值(A值)，繪制生長曲線。

1.5 多向分化能力檢測

1.5.1 成脂分化 選P3的ADSCs和BMSCs，以3×105的密度接種于6 孔板內(nèi)，待細胞密度達到80%～90%時，更換成脂誘導(dǎo)液。14 d后，多聚甲醛固定,油紅O染色,顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.2 成骨分化 選P3的ADSCs和BMSCs，以3×105的密度接種于6 孔板內(nèi)，待細胞密度達到80%～90%時，更換成骨誘導(dǎo)液。

ALP染色：誘導(dǎo)7 d后固定，ALP室溫避光孵育30 min，PBS洗滌終止顯色反應(yīng)。半定量分析：使用ImageJ軟件，選取多個視野，設(shè)置相同閾值，比較染色區(qū)占總視野比值，定量對比。

天狼猩紅染色：誘導(dǎo)14 d后固定，1%天狼猩紅染色18 h， 0.1 mol/L醋酸洗去多余染液，鏡下拍照。半定量分析：每孔加入1 ml 0.2 mol/L NaOH/甲醇(1∶1)洗脫液， 在540 nm波長處吸光度值并比較。

茜素紅染色：誘導(dǎo)28 d后固定。0.1%茜素紅染液室溫避光孵育2～3 min至顯色，鏡下觀察拍照。半定量分析：加入1 ml氯化十六烷吡啶洗脫液,置于搖床緩慢搖動2 h， 比較兩者在620 nm波長處吸光度值。

1.6 成骨相關(guān)基因?qū)Ρ?/h3>

成骨誘導(dǎo)3、 7、 14 d， 提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄，qPCR檢測成骨相關(guān)基因的表達。具體操作步驟參考TIABGEN?及TAKARA?試劑盒說明書，引物由北京奧科生物合成(表 1)。

表1 qPCR引物序列

1.7 膜片電鏡及HE對比

常規(guī)培養(yǎng)2 組細胞匯合至90%，更換成膜誘導(dǎo)液(含50 μg/ml抗壞血酸)。 10 d后取膜片進行HE染色和電鏡觀察。利用PS軟件測量膜片厚度并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析， 2 組比較采用成組t檢驗，不同時間兩組比較采用多因素方差分析，檢驗水準為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 糖尿病建模結(jié)果

成模后，糖尿病組隨機血糖穩(wěn)定維持大于16.7 mmol/L(表 2), 2 組大鼠血糖值具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 細胞形態(tài)觀察

原代培養(yǎng)第2 天，見少量ADSCs細胞貼壁， 第4～5 天細胞密度可達80%。BMSCs于第3 天開始貼壁， 7～8 d細胞密度可達80%。細胞形態(tài)多為長梭形，多角形或星形(圖 1)。

2.3 克隆形成率及生長曲線測定

細胞在接種后第10 天，均形成大量細胞克隆。ADSCs和BMSCs克隆形成率分別為35.67%和25.67%， 2 種干細胞之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖 2)。

表 2 糖尿病和正常大鼠血糖值比較Tab 2 Comparison of blood glucose values between diabetic and normal rats (mmol/L，

圖1 ADSCs及BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 (倒置顯微鏡，×40) 圖 2 細胞克隆形成率和增殖曲線(*:P<0.05; **:P<0.01)

Fig 1 The morphology of AD SCs and BMSCs Fig 2 Clone formation rate and growth cure of ADSCs and BMSCs (Inverted microscope, ×40) (*:P<0.05; **:P<0.01)

細胞均形成顯著的S形生長曲線。第一天細胞生長處于滯留期。自第2 天起進入對數(shù)生長期，第7 天到達平臺期。ADSCs的增殖速率于第3 天后逐漸高于BMSCs,在第4、 5、 7 天時相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖 2)。

2.5 多向分化能力檢測

2.5.1 成脂分化 2 組細胞均可產(chǎn)生脂滴，脂滴融合為串珠樣。ADSCs形成的脂滴數(shù)量多且體積較大；BMSCs形成的數(shù)量少且較小(圖 3)。證實2 種細胞均可定向成脂分化。

2.5.2 成骨分化 ALP染色及定量: 細胞均呈藍紫色著色，BMSCs中ALP的表達量明顯高于ADSCs(圖 3)。通過ImageJ軟件進行兩樣本中多個視野染色面積對比，統(tǒng)計分析顯示兩種細胞有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

天狼猩紅染色及定量： ADSCs呈現(xiàn)粗大的膠原束，而BMSCs形成的膠原較為細小(圖 3)。定量結(jié)果表明:ADSCs的膠原分泌量高于BMSCs， 2 種細胞的染色結(jié)果相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)。

茜素紅染色及定量： BMSCs有更多的礦化結(jié)節(jié)形成，少量連接成小片狀，而ADSCs形成的礦化結(jié)節(jié)較少(圖 3)。半定量分析表明：BMSCs組的鈣鹽沉積量顯著高于ADSCs組，兩者相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖 3 細胞多向分化

2.5 成骨相關(guān)基因表達對比

COL-1的表達隨時間變化呈逐漸升高趨勢，成骨晚期ADSCs中COL-1的表達顯著高于BMSCs。ALP、BMP的表達隨時間變化呈逐漸降低趨勢，成骨早期BMSCs中ALP、BMP的表達顯著高于ADSCs。整個過程中OCN、RUNX2、OSX在BMSCs中表達量顯著高于ADSCs(圖 4)。

圖 4 ADSCs及BMSCs成骨相關(guān)基因的表達

2.6 成膜能力對比

2 組細胞均可形成大量的細胞外基質(zhì)，連接成片狀。細胞之間通過板狀偽足連接。橫截面見ADSCs膜片厚度明顯大于BMSCs(圖 6)，兩者之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。HE染色顯示兩種細胞均形成細胞-基質(zhì)-細胞三明治樣結(jié)構(gòu)，ADSCs膜片擁有更多的細胞層數(shù)以及更豐富的細胞外基質(zhì)(圖 6)，說明ADSCs比BMSCs擁有更強的增殖能力和膠原分泌的能力。

圖 5 細胞膜片掃面電鏡觀及HE染色

3 討 論

近年來，組織工程技術(shù)應(yīng)用干細胞提升糖尿病患者的成骨能力，已得到多種證據(jù)證實[9]。大部分實驗基于異體干細胞的獲取，而在臨床上，此種方法受到一定限制，且其面臨的體內(nèi)的免疫原性仍具有爭議性。自體干細胞因其臨床易得，能促進長期移植的生存和移植耐受，而成為更有前景的細胞[10]。

現(xiàn)有證據(jù)表明，糖尿病患者來源的BMSCs相比正常BMSCs，數(shù)量減少，再生能力減弱，增殖和存活能力降低[11-12]，成骨分化顯著下降[13]，限制了其在再生方向的應(yīng)用。而糖尿病患者來源的ADSCs，獲取數(shù)量并未減少，生長曲線和對照組類似[14]。對于糖尿病患者自體的ADSCs和BMSCs的比較，卻并無較多討論。

通過比較糖尿病大鼠來源的ADSCs和BMSCs的克隆和增殖能力發(fā)現(xiàn)，兩種細胞均可形成克隆，但ADSCs形成能力更佳。而細胞增殖曲線也表明ADSCs具有更好的增殖潛力。

ALP及茜素紅染色顯示，BMSCs具有更為顯著的成骨能力。但ADSCs膠原定量結(jié)果顯著高于BMSCs，其可形成更多更粗壯纖維。同時ADSCs中COL-1的表達量顯著高于BMSCs。細胞膜片電鏡及HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADSCs形成膜片的層數(shù)及厚度的均顯著高于BMSCs，ADSCs擁有更強的增殖和膠原分泌的能力。但其他的骨形成相關(guān)基因，在 BMSCs中的表達顯著高于ADSCs。

ADSCs來源廣泛、取材容易、患者痛苦小[15]。正常的ADSCs同時顯示出類似于BMSCs的遷移，分化，免疫抑制能力[16]。來源于糖尿病的ADSCs相比BMSCs具有更好的增殖潛力，可能是骨髓中的低氧環(huán)境導(dǎo)致BMSCs面臨早期的增殖老化[17]。ADSCs能形成更多的膠原及細胞外基質(zhì)，但BMSCs具有更佳的成骨能力，考慮可能是其他成骨相關(guān)基因或后期鈣磷沉積的優(yōu)勢作用。雖然BMSCs的特殊性能可提升其應(yīng)用潛力，但在再生領(lǐng)域中，細胞增殖是促進創(chuàng)傷愈合及組織再生的重要部分，通過體內(nèi)提升增殖能力來激活內(nèi)源性干細胞也成為治療糖尿病并發(fā)癥的潛在策略[18],且ADSCs更適應(yīng)標(biāo)準的培養(yǎng)環(huán)境，體外培養(yǎng)可形成更穩(wěn)定的細胞特性[17]。就此而言，糖尿病患者ADSCs相比BMSCs在自體干細胞應(yīng)用中具有更好的前景。