馬苗苗 李成浩 劉 曉 張 馨 楊靜莉

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

日本落葉松(Larixkaempferi)為松科(Pinaceae)落葉松屬(Larix)的落葉喬木，為我國東北林區(qū)的主要森林樹種，分布于大、小興安嶺海拔300～1 200 m地帶。喜光性強(qiáng)，對水分要求較高，在各種不同環(huán)境下均能生長，而以生于土層深厚、肥潤、排水良好的北向緩坡及丘陵地帶生長旺盛[1]。日本落葉松作為北方林區(qū)的主要造林樹種，具有生長快、適應(yīng)性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的特點(diǎn)，因而常被用于東北地區(qū)的荒山造林及紙漿用材林營建[2～3]。然而北方春季易發(fā)生干旱，干旱脅迫作為一種最普遍的樹木逆境形式，影響樹木的生長發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)可降低林木的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]，進(jìn)而會(huì)嚴(yán)重影響日本落葉松的成活率。為提高日本落葉松利用效率，我國對落葉松進(jìn)行的遺傳改良早期主要集中在規(guī)?；敝撑涮准夹g(shù)，但是該過程操作復(fù)雜周期長，工程量大[5]，不適合短時(shí)間的育種改良體系。隨著時(shí)間的推進(jìn)以及基因工程的飛速發(fā)展，基因工程為縮短育種周期提供了重要選擇，因此研究落葉松遺傳改良的基因工程越來越受到重視。

植物激素中的乙烯對植物的生長發(fā)育有著多方面的影響，同時(shí)也參與植物生物脅迫和非生物脅迫的調(diào)控[6～8]。ERF轉(zhuǎn)錄因子即乙烯應(yīng)答因子，又稱為乙烯應(yīng)答鍵結(jié)合蛋白，是乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白家族的一個(gè)重要的亞族[9]，其所包含的AP2區(qū)域廣泛參與到植物的各種生理反應(yīng)中，并且積極地響應(yīng)各種逆境脅迫和發(fā)育信號，在植物的生長發(fā)育過程中起著十分重要的作用。ERF類轉(zhuǎn)錄因子的分類，根據(jù)氨基酸序列的不同分為三類，第一和第三類起到激活轉(zhuǎn)錄的作用，第二類可以抑制轉(zhuǎn)錄[10]。依據(jù)進(jìn)化關(guān)系分類，ERF家族又可以分為B1、B2、B3、B4、B5和B6等6個(gè)組[11～12]。ERF轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)，主要由DNA結(jié)合域、核定位信號域(NLS)以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控域構(gòu)成其蛋白結(jié)構(gòu)[13]。而ERF轉(zhuǎn)錄因子的功能，也是植物所特有的[9]。ERF不僅自身表達(dá)處在復(fù)雜的調(diào)控途徑中，并且在植物的生物與非生物脅迫誘導(dǎo)不同信號之間起調(diào)控作用，并參與逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。相關(guān)研究表明，ERF轉(zhuǎn)錄因子在提高農(nóng)作物抗旱性和耐鹽性中起到了至關(guān)重要的作用[14～15]。例如：在水稻中過量表達(dá)TERF1后增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻對干旱和高鹽脅迫的耐受力[16]；在番茄中ERF5的過量表達(dá)可以增加番茄對干旱和鹽脅迫的適應(yīng)性[17]；在擬南芥的研究中表明ERF4的過量表達(dá)可以提高其抗旱和抗鹽的能力[18]；在楊樹中ERF5.1可能是參與干旱脅迫的重要轉(zhuǎn)錄因子[19]；而在煙草中ERF3的過量表達(dá)可以提高煙草對干旱和鹽脅迫的抗性[20]。隨著研究的發(fā)展與深入，在大豆[21]、葡萄[22]、棉花[23]、大薯[24]等多種植物中發(fā)現(xiàn)了該類轉(zhuǎn)錄因子。

近年來ERF轉(zhuǎn)錄因子成為分子生物學(xué)的熱點(diǎn)之一，而落葉松作為一種重要的林業(yè)樹種還未涉及，因此本文以落葉松為研究對象，通過生物信息學(xué)技術(shù)分析預(yù)測了ERF基因的功能及結(jié)構(gòu)，同時(shí)分析了該基因在落葉松干旱脅迫下的表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1 植物材料

利用本實(shí)驗(yàn)室播種培養(yǎng)的日本落葉松土培苗，溫室生長環(huán)境為25℃，光周期為16 h/8 h。培養(yǎng)基質(zhì)是蛭石和土(1∶1)，培養(yǎng)120 d左右，選取株高10～15 cm的落葉松幼苗為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 日本落葉松RNA的提取及cDNA的合成

取日本落葉松幼苗頂芽向下5 cm左右放入液氮中研磨，利用無錫百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的通用植物總RNA提取試劑盒，提取落葉松總RNA,使用南京諾唯贊生物公司生產(chǎn)的Hi Script?Ⅱ QRT SuperMix for qPCR(+gDNAwiper)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄的總cDNA置于-20℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 日本落葉松LoERF017基因的克隆

通過本實(shí)驗(yàn)室前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到該基因的序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì)ERF5-2的基因引物，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增技術(shù)得到LoERF017基因。

在該基因序列兩端分別設(shè)計(jì)引物，由擎科生物公司合成正向引物F：5′-ATGGAGATATTCCCCCAGCAGG-3′以及反向引物R：3′-TCAAACGTCCTGGAAGTTCC-5′。以東洋紡生物公司生產(chǎn)的KOD酶進(jìn)行擴(kuò)增PCR，克隆出LoERF017基因的全長片段。PCR總反應(yīng)體系為200 μL，共10管，每管20 μL，其中cDNA模版1 μL、正反向引物各1 μL、dNTP 4 μL、10*KOD Buffer10 μL、KOD酶0.4 μL、去離子水2.6 μL。

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，98℃變性10 s，60℃退火30 s，68℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，68℃延伸7 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，使用DL2000 DNA Marker做目的片段長度的比對，在電泳檢測目的條帶長度正確后，使用AXYGEN回收試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，具體步驟見試劑盒說明書。膠回收產(chǎn)物使用AXYGEN純化試劑盒做產(chǎn)物純化，純化后的產(chǎn)物連接T載體，利用熱激法將其轉(zhuǎn)化于大腸桿菌中，搖菌2 h，菌液離心抽取上清于150 μL重懸涂板，次日挑取平板內(nèi)生長的大腸桿菌單個(gè)菌體12個(gè)37℃搖菌，菌液渾濁后PCR，產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步檢測，挑選條帶長度正確的菌液送擎科生物公司測該基因序列。

1.2.3 植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-LoERF017-GFP的構(gòu)建

1.2.3.1 設(shè)計(jì)載體的雙酶切引物

通過分析LoERF017基因全長序列及pCAMBIA1300-GFP載體圖譜，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的基因引物。在載體圖譜的多個(gè)插入位點(diǎn)中找出載體可用的全部酶切位點(diǎn)，以篩選可使用的限制性內(nèi)切酶，然后將該基因全長序列輸入到BioEdit軟件中，通過軟件分析得到不能切斷該基因的限制性內(nèi)切酶，以此選取出既可以切斷載體又不會(huì)切斷基因的限制性內(nèi)切酶作為最終所用酶。本實(shí)驗(yàn)選取BamHⅠ和SalⅠ兩個(gè)限制性內(nèi)切酶，并根據(jù)所使用的內(nèi)切酶確定酶切位點(diǎn)序列，由此設(shè)計(jì)正向酶切引物F:5′-CGCTAGGATGGAGATATTCCCCCAGCAGG-3′反向酶切引物R:3′-CGTCGAGTCAAACGTCCTGGAAGTTCC-5′。

1.2.3.2 目的基因PCR擴(kuò)增及膠回收

酶切引物合成后，以測序比對序列成功的菌液提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在120 V電壓下，以電泳檢測目的條帶長度是否正確，若條帶正確則利用購自南京諾唯贊生物公司的2×Easy Taq Master Mix以膠回收體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后使用AXYGEN膠回收試劑盒對其進(jìn)行膠回收，并按AXYGEN產(chǎn)物純化試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行純化。

1.2.3.3 pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒的提取

在20 mL含濃度為50 mg·L-1的卡那霉素(Kana)的LB液體培養(yǎng)基加入20 μL轉(zhuǎn)入pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒的大腸桿菌菌液，置于37℃搖床上160 r·min-1震蕩培養(yǎng)15 h，使用AXYGEN質(zhì)粒小提試劑盒提取pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒，具體操作方法見試劑盒說明書。

1.2.3.4 目的基因與載體的雙酶切反應(yīng)及純化

將膠回收產(chǎn)物和pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行BamHⅠ/SalⅠ雙酶切，酶切體系如下(100 μL)，反應(yīng)條件為37℃，時(shí)間為2～3 h。最后使用AXYGEN純化試劑盒對酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行純化。雙酶切總反應(yīng)體系均為100 μL，其中pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒50 μL、0×T Buffer 10 μL、BamHⅠ 5 μL、SalⅠ 5 μL、去離子水30 μL。膠回收產(chǎn)物50 μL、0×T Buffer 10 μL、BamHⅠ 5 μL、SalⅠ 5 μL、去離子水30 μL。

1.2.3.5 雙酶切產(chǎn)物的連接

將酶切后的基因與載體使用全式金T4連接酶進(jìn)行連接，連接體系如下。基因：載體3∶1；T4酶1 μL；5×Buffer 2 μL；去離子水2 μL；總體積10 μL。反應(yīng)條件：20℃，2 h。

1.2.3.6 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及PCR檢測

將連接所得產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，搖菌2 h后離心，抽離剩下100 μL菌液打到無菌的含50 mg·L-1Kana的LB固體培養(yǎng)基平板中，用酒精燈燒過的無菌涂棒涂至均勻。在37℃搖床中倒置過夜培養(yǎng)后，次日挑取單克隆菌落搖菌，然后進(jìn)行菌液PCR及電泳檢測，并將陽性的菌液抽取500 μL送去測序，剩余菌液和50%甘油按1∶1比例混勻加入無菌的1.5 mL離心管中，充分混勻放入液氮快速冷凝，-80℃冷凍保存。測序比對正確后的菌液使用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒pCAMBIA1300-LoERF017-GFP。

1.2.4 日本落葉松LoERF017基因生物信息學(xué)及進(jìn)化樹分析

利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線軟件分析該基因的開放閱讀框；通過http://www.bio-soft.net/sms/index.html查詢該基因的同源核苷酸及氨基酸序列；利用Ex PASy服務(wù)器中的Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)工具分析蛋白的理化性質(zhì)；根據(jù)ExPASy(https://web.expasy.org/protscale/)服務(wù)器中的ProtScale程序分析該基因蛋白的疏水性；通過SOPMA程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用Swiss-Model程序?qū)υ摶蜻M(jìn)行三級結(jié)構(gòu)同源建模；通過TMHMM Server v.2.0(https://www.cbs.dtu.dk/)對蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析；使用Signal P 3.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)對蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，并預(yù)測該蛋白質(zhì)N端信號肽的有無及其酶切位點(diǎn)；使用COILS Server(https://embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html)對該蛋白卷曲螺旋預(yù)測分析；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi在線預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域；通過http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html進(jìn)行氨基酸多序列比對；通過http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl網(wǎng)址進(jìn)行氨基酸結(jié)構(gòu)比對；利用MEGA5.05軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 亞細(xì)胞定位

構(gòu)建pCAMBIA1300-LoERF017-GFP基因融合綠色熒光蛋白(GFP)瞬時(shí)表達(dá)載體，利用AXYGEN質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒。將pCAMBIA1300-LoERF017-GFP質(zhì)粒和pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒分別與金粉包裹，用基因槍(PDS-1000/He Particle Delivery System)轟擊放置在1/2MS培養(yǎng)基的2 cm×2 cm的洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)24 h，之后用激光共聚焦顯微鏡(OlympusFV1000MPE)觀察亞細(xì)胞定位情況。

1.2.6 日本落葉松LoERF017基因的表達(dá)模式分析

采用實(shí)驗(yàn)室播種培養(yǎng)的日本落葉松幼苗，生長環(huán)境為25℃組培室，光周期為16 h/8 h，3～5 d澆一次水，生長120 d左右停止?jié)菜酝Ｖ節(jié)菜牡?天為0 d取材生長狀態(tài)良好且一致的土培苗，2棵為1組取3組，分別提取根莖葉的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR以分析該基因在日本落葉松不同組織中的特異性表達(dá)。

以0 d的落葉松為對照組，干旱脅迫1、3、5、7 d的材料為實(shí)驗(yàn)組，分別提取各個(gè)脅迫時(shí)間實(shí)驗(yàn)材料根的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR以分析干旱脅迫下該基因在日本落葉松根中的表達(dá)情況。干旱脅迫第7天取材后，對落葉松幼苗澆水，在恢復(fù)正常間隔3 d澆水期間，對落葉松根進(jìn)行間隔1 d的連續(xù)4次取材，即復(fù)水的第1、3、5、7天，分別提取根的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR以研究復(fù)水后，該基因在根中的表達(dá)情況。

使用落葉松基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)內(nèi)參引物由庫美公司合成正向引物tubulin-F:ATTATGAAGAGGTCGGAGCAG-3′以及反向引物tubulin-R:CCCCACCAGTACTACCTATCAA-3′，長度為199 bp。同時(shí)合成基因正向引物qPCR-F:5′-GAGATATTCCCCCAGCAGGAAC-3′，反向引物qPCR-R:3′-TCGGATTCCCTTATATTGGCGG-5′，長度為84 bp。

以RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版，使用南京諾唯贊生物生產(chǎn)的Cham QTMUniversal SYBR? qPCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR，通過熒光定量PCR儀(Applied Bio systems,Foster City,CA,USA)進(jìn)行PCR，用2-ΔΔCT計(jì)算法計(jì)算其相對表達(dá)量。

PCR總反應(yīng)體系為20 μL，其中cDNA模版1 μL、正反向引物各1 μL、2×Easy Taq PCR Super Mix酶10 μL、去離子水7 μL。反應(yīng)條件：94℃ 30 s；94℃ 5 s、60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；60℃ 6 s；70個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本落葉松LoERF017基因的克隆

以日本落葉松為材料提取頂芽向下5 cm左右的總RNA(如圖1所示)。利用落葉松總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以Marker2000為片段長度對照，擴(kuò)增ERF基因的CDS序列，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為624 bp(如圖2所示)。

圖1 落葉松RNA的提取 M. DNA Marker DL2000；1～5.RNA產(chǎn)物Fig.1 The RNA production of L.kaempferi M.DNA Marker DL2000；1-5.RNA production

圖2 落葉松LoERF017基因的克隆 M.DNA Marker DL2000；1～5.LoERF017克隆產(chǎn)物Fig.2 PCR production of LoERF017 M.DNA Marker DL2000；1-5.PCR production of LoERF017

2.2 日本落葉松LoERF017基因編碼的氨基酸序列及其理化特性

2.2.1 日本落葉松LoERF017基因編碼的氨基酸序列

通過在線查詢LoERF017基因共編碼206氨基酸(如圖3所示)。利用ExPASy服務(wù)器中的Protparam工具分析蛋白的理化性質(zhì)，分析結(jié)果氨基酸的數(shù)量為206，分子質(zhì)量為23 458.370理論等電子點(diǎn)為5.43，總共包括3 278個(gè)原子，分子式為C1042H1624N284O323S5，在組成蛋白的20種氨基酸中，絲氨酸(Ser)所占比例最高，占10.6%，半胱氨酸(Cys)所占比例最低，占0.5%，不包括含硒半胱氨酸(Sec)和吡咯賴氨酸(Pyl)。蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為61.41，脂肪指數(shù)為76.86，總平均親水性為-0.632。

2.2.2 日本落葉松LoERF017基因的理化特性

2.2.2.1 日本落葉松LoERF017基因編碼的蛋白疏水性

根據(jù)ExPASy服務(wù)器中的ProtScale程序分析落葉松ERF蛋白的疏水性，計(jì)算基于K-D法的蛋白質(zhì)疏水性。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第196位的氨基酸為亮氨酸(Iie)，疏水性最大，分值為4.500；第26位的氨基酸為精氨酸(Arg)，親水性最大，分值為-4.500。根據(jù)圖4中數(shù)據(jù)，分值為負(fù)值的氨基酸數(shù)量大于分值為正值的氨基酸數(shù)量，表示親水性大于疏水性，因而推測該蛋白為親水性蛋白。

2.2.2.2 落葉松LoERF017基因編碼的蛋白的二級結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過在線預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)，如圖5所示該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要是由α-螺旋(30.43%)，無規(guī)卷曲(54.11%)，延伸鏈(12.56%)，β-折疊(2.9%)組成。

2.2.2.3 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過把氨基酸序列輸入到Swiss-Model程序中，對LoERF017基因所編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(如圖6所示)。

2.2.2.4 對蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行分析

通過把氨基酸序列輸入到TMHMM Server v.2.0中，對LoERF017該基因所編碼的蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析，該蛋白長度為206；預(yù)測TMHs的數(shù)量為0；TMHs中AAs的Exp號是0；Exp編號，前60個(gè)AAs為0；其在N端的可能性為0.03768，如圖7所示，在細(xì)胞膜表面，該基因并沒有典型的跨膜螺旋區(qū)，細(xì)胞膜內(nèi)也沒有氨基酸，同時(shí)通過對該蛋白的疏水性區(qū)域分析結(jié)果，可以得出該蛋白與細(xì)胞信號傳導(dǎo)無關(guān)。

2.2.2.5 蛋白信號肽及蛋白卷曲螺旋預(yù)測分析

通過SignalP3.0 server對該基因所編碼的蛋白進(jìn)行蛋白信號肽預(yù)測，結(jié)果預(yù)測蛋白質(zhì)Non-secretory蛋白質(zhì)信號肽概率:0.000；信號錨定概率:0.000；最大劈理位點(diǎn)概率:pos.-1和0之間的0.000,結(jié)果如圖8所示。利用COILS Server對該蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，結(jié)果如圖9所示，該蛋白不具有肝蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

圖5 LoERF017蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Predicted secondary structure prediction of LoERF017 protein

圖6 LoERF017蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Predicted tertiary structure prediction of LoERF017 protein

圖7 LoERF017蛋白的跨膜區(qū)分析Fig.7 Transmembrane region prediction of LoERF017 protein

圖8 LoERF017蛋白的信號肽預(yù)測Fig.8 Signal peptide prediction of the LoERF017 protein

圖9 LoERF017蛋白的卷曲螺旋預(yù)測Fig.9 Coiled Coils prediction of LoERF017 protein

2.2.2.6 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi在線分析蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，如圖10所示，通過分析得出該基因所編碼的蛋白，包括AP2和KRBA1兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。LA2是1994年由Jofuku等從擬南芥鑒定出來的，在LA蛋白中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)重復(fù)的DNA結(jié)構(gòu)域，稱這類DNA結(jié)構(gòu)域?yàn)锳P2結(jié)構(gòu)域[3]。AP2結(jié)構(gòu)域由第27到90的64個(gè)氨基酸構(gòu)成AP2結(jié)構(gòu)域，AP2結(jié)構(gòu)域廣泛存在于植物蛋白中。該結(jié)構(gòu)域可以利用乙烯、脫落酸、茉莉酸和水楊酸等信號來調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而提高植物的抗逆性。

圖10 LoERF017蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.10 Conserverd domain prediction of LoERF017 coded protein

圖11 日本落葉松LoERF017氨基酸與其他植物氨基酸序列比對框選為保守區(qū)域Fig.11 L.kaempferi alignment analysis of LoERF017 conservative structure domain in different plants Boxes selected as conservative areas

圖12 不同植物L(fēng)oERF017基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法)及保守區(qū)域Fig.12 Molecular phylogenetic tree analysis of LoERF017 in plant species

圖13 LoERF017基因的亞細(xì)胞定位分析Fig.13 Subcellular localization analysis of the LoERF017 gene

2.2.2.7 氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

通過在線比對氨基酸序列，將日本落葉松LoERF017基因所翻譯的氨基酸序列與相同基因的其他物種的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果所示：日本落葉松(Larixkaempferi)LoERF017基因與火炬松(Pinustaeda)、北美云杉(Piceastichensis)等物種的同源蛋白序列有較高保守性(如圖11所示)。利用MEGA5.05軟件對該同源蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，如圖12所示，日本落葉松(Larixkaempferi)與火炬松(Pinustaeda)、北美云杉(Piceastichensis)親緣關(guān)系最近，同時(shí)與蒲桃(Syzygiumoleosum)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、油棕(Elaeisguineensis)、可可(Theobromacacao)、鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)、博落回(Macleayacordata)、結(jié)縷草(Zoysiajaponica)、罌粟(Papaversomniferum)、狹葉羽扇豆(Lupinusangustifolius)、川桑(Morusnotabilis)、狗尾草(Setariaviridis)有較遠(yuǎn)的遺傳距離，所以預(yù)測他們有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。同時(shí)與大豆(Glycinemax)、歐洲油菜(Brassicanapus)、刺毛黧豆(Mucunapruriens)遺傳距離最遠(yuǎn)，因此預(yù)測他們親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。

2.3 日本落葉松LoERF017基因的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用基因槍將pCAMBIA1300-LoERF017-GFP質(zhì)粒和pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒分別與金粉包裹，轟擊放置在1/2MS培養(yǎng)基的2 cm×2 cm的洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)24 h后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果如圖13所示。對照組pCAMBIA1300-GFP空載體的綠色熒光充斥整個(gè)洋蔥細(xì)胞，為組成型表達(dá)。pCAMBIA1300-LoERF017-GFP的融合表達(dá)載體的綠色熒光只在細(xì)胞核中，表明該基因定位在細(xì)胞核中，并且具有轉(zhuǎn)錄因子的一般特征。

2.4 落葉松LoERF017基因的表達(dá)模式分析

分別提取0 d的落葉松根、莖、葉RNA，以檢測LoERF017基因在日本落葉松中的組織特異性表達(dá)，如圖14所示，該基因在莖中的表達(dá)量是根的0.29倍，在葉中的表達(dá)是根的0.55倍，因此可以預(yù)測，該基因在日本落葉松的根中表達(dá)量最高，在莖中最低，在葉中的表達(dá)量居中。

以0 d根的表達(dá)量為對照組，分別以干旱脅迫后1、3、5、7 d根的表達(dá)量為實(shí)驗(yàn)組，分析干旱脅迫下該基因在根中的表達(dá)情況，同時(shí)在恢復(fù)對落葉松的正常澆水間隔之后，分析該基因在落葉松根中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖15所示，干旱脅迫下根中的表達(dá)量呈上升趨勢，干旱脅迫復(fù)水后，該基因在根中的表達(dá)量有下降趨勢，表明復(fù)水后該基因的調(diào)控作用趨緩，由此可以推測該基因主要在日本落葉松的根中表達(dá)并行使功能，并且該基因可能與抗旱性相關(guān)。

圖14 LoERF017基因在日本落葉松不同組織中的特異性表達(dá)情況Fig.14 Specific expression of LoERF017 gene in different tissues of L.kaempferi

圖15 LoERF017基因在干旱處理及復(fù)水后在根中的表達(dá)情況Fig.15 Quantitative real-time PCR analysis of the expression pattern of LoERF017 gene in roots after drought treatment and rehydration

3 討論

日本落葉松樹體高大、樹干通直、材質(zhì)堅(jiān)韌，是一種重要的造林用材樹種，在造紙業(yè)和園林綠化中也被廣泛應(yīng)用，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此提高日本落葉松的抗逆性對我國林業(yè)具有多方面的意義。而且利用基因工程的育種手段無疑加快了整個(gè)育種進(jìn)程，縮減了育種工程量，為育種工程提供了極大的便利。

本文從基因工程角度出發(fā)，在日本落葉松中克隆獲得的LoERF017基因，共含624 bp的CDS序列，共編碼206個(gè)氨基酸。預(yù)測該基因所編碼的蛋白只包括AP2一個(gè)結(jié)構(gòu)域，不含有指導(dǎo)蛋白的信號肽和跨膜運(yùn)輸結(jié)構(gòu)，且為親水蛋白。該基因所編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋(30.43%)，無規(guī)卷曲(54.11%)，延伸鏈(12.56%)，β-折疊(2.9%)組成。通過亞細(xì)胞定位，得到LoERF017基因定位在細(xì)胞核中。QRT-PCR結(jié)果表明，在日本落葉松的組織特異性表達(dá)中，LoERF017基因在根中的表達(dá)量最高，在莖中的表達(dá)量最低，在葉中的表達(dá)量居中。并且干旱脅迫下，該基因在根中的表達(dá)量有明顯的上升趨勢，對其復(fù)水后該基因在根中的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢。這一結(jié)果與研究干旱脅迫條件下長春花Str和Pme基因表達(dá)變化中Str基因在干旱及復(fù)水后的表達(dá)結(jié)果相一致[25]。由此預(yù)測LoERF017與日本落葉松的抗旱調(diào)控相關(guān)。

通過對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，可以判斷出本文所克隆的LoERF017基因?qū)儆贓RF轉(zhuǎn)錄因子中的激活轉(zhuǎn)錄類，該基因可以在日本落葉松受到逆境脅迫時(shí)提高自身表達(dá)量，進(jìn)而提高落葉松的抗逆性。這個(gè)研究結(jié)果與在其他一些物種中的ERF轉(zhuǎn)錄因子與干旱誘導(dǎo)反應(yīng)密切相關(guān)所一致。并且相關(guān)研究表明，在擬南芥中轉(zhuǎn)入LoERF017基因所得到的轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系的根長、鮮重及長勢都明顯優(yōu)于野生型株系，證明了LoERF017基因可以提高擬南芥的抗旱性[26]。除擬南芥中對LoERF017在植物中抗旱性的探討，還并未在其他物種中對該基因的抗旱性做深入研究，由此該結(jié)論可直接證明本文對LoERF017在日本落葉松中的研究結(jié)果。

通過以上研究，可以初步證明落葉松LoERF017基因與日本落葉松的抗旱能力相關(guān)，但是關(guān)于該轉(zhuǎn)錄因子對植物抗逆性的調(diào)控機(jī)制和信號傳導(dǎo)等具體的功能還有待進(jìn)一步的研究證明。該基因的發(fā)現(xiàn)，為日本落葉松物種的基因組測序工作的完成提供了更多的數(shù)據(jù)參考，也為日本落葉松的抗旱研究提供了更多的理論基礎(chǔ)。