孔 晉,吳文涌, 吳正升

胃癌(gastric cancer，GC)是世界第五大常見的癌癥，近年來發(fā)病率在不斷上升[1]。胃癌預(yù)后較差，5年生存率低于30%，部分原因是腫瘤細(xì)胞的快速侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)行為之一，其過程包括細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinase family, MMPs)、金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)等的失調(diào)。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蓄積是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素。ECM受MMPs及其內(nèi)源性抑制劑TIMPs的調(diào)節(jié)。MMPs組織TIMP-4是一種抑制MMPs活性的蛋白質(zhì)。研究[3]表明TIMP-4表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)后、分期及疾病進(jìn)展相關(guān)。TIMP-4在胃癌中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后關(guān)系的研究較少。TIMP-4通過抑制 MMPs介導(dǎo)的活化來調(diào)節(jié)明膠酶A的活性。MMP-2是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志，參與ECM和基底膜Ⅳ型膠原的降解，在細(xì)胞遷移過程中起重要作用[4]。因此該研究從蛋白水平探討胃癌中TIMP-4和MMP-2表達(dá)情況，并分析兩者之間關(guān)聯(lián)性，為研究GC 的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年10月～11月通過手術(shù)切除經(jīng)病理證實(shí)的、臨床病理資料完整的GC組織存檔蠟塊75例。所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療或生物治療等干預(yù)措施。其中男 55例，女20例，年齡35～81(62±10.22)歲；腫瘤直徑≤5 cm 44例，>5 cm 31例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例；按胃癌分化程度：中高分化腺癌30例，低分化腺癌45例；按第8版國際抗癌聯(lián)盟和美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[5]：Ⅰ期+Ⅱ期36例，Ⅲ期+Ⅳ期39例。收集相應(yīng)癌旁組織(距癌組織邊緣2 cm以上)存檔蠟塊42例。參與本次研究的所有患者均同意并簽署知情同意書。相關(guān)樣品的收集和處理都是在遵守《赫爾辛基宣言》[6]的情況下進(jìn)行并經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器兔抗人TIMP-4(12326-1-AP，工作濃度1 ∶100)多克隆抗體及鼠抗人MMP2(66366-1-1g，工作濃度1 ∶75)單克隆抗體均由美國Proteintech Group公司生產(chǎn)；即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒(KIT5020)購自福州邁新公司；DAB顯色劑(ZLI9018)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；OlympusCX22生物顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法所有收集的組織存檔蠟塊經(jīng)4 μm厚連續(xù)切片，行免疫組織化學(xué)染色。染色結(jié)果經(jīng)2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲原則評(píng)定。免疫組化染色采用EnVision法。主要步驟如下：4 μm厚的石蠟切片65 ℃烤片，脫蠟水化，經(jīng)檸檬酸鈉緩沖液高壓加熱抗原修復(fù)，3% H2O2作用10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。一抗(MMP-2、TIMP-4)4 ℃過夜孵育，PBS清洗后每張切片滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37 ℃干燥箱孵育30 min，DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察染色情況，陽性對(duì)照使用MMP-2、TIMP-4表達(dá)良好的胃組織，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷對(duì)TIMP-4和MMP-2的表達(dá)水平進(jìn)行半定量的評(píng)估。顯微鏡下觀察切片，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性。對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行染色程度的得分評(píng)判，同時(shí)對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。將染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比結(jié)合判斷TIMP-4和MMP-2蛋白免疫組化結(jié)果。結(jié)果判斷采用半定量積分法：① 著色強(qiáng)度打分：0分，細(xì)胞無著色；1分，細(xì)胞著色為淺黃色；2分，細(xì)胞著色為棕黃色；3分，細(xì)胞著色為棕褐色；染色強(qiáng)度需與背景著色相對(duì)比。② 根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比打分：0分，陰性；1分，陽性細(xì)胞≤10%；2分，陽性細(xì)胞>10%～50%；3分，陽性細(xì)胞>50%～75%；4分，陽性細(xì)胞>75%。按著色強(qiáng)度分值與陽性細(xì)胞百分比分值乘積結(jié)果將切片分為4個(gè)等級(jí)：“-”：0～2分；“+”：3～5分；“”： 6～8分；“”：9～12分；以≥3分判定為免疫反應(yīng)陽性[7]。

1.5 Kaplan-Meier生存分析和臨床表達(dá)分析Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/)是一個(gè)綜合的在線平臺(tái)，可基于10 293例癌癥樣品評(píng)估54 675個(gè)基因?qū)ι娴挠绊?。本研究使用Kaplan-Meier繪圖儀評(píng)估TIMP-4和MMP-2的預(yù)后價(jià)值及其在胃癌患者中的表達(dá)。從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得527例胃癌組織和349例癌旁組織中TIMP-4 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)；以及570例胃癌組織和306例匹配的癌旁正常組織中MMP-2 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析，各組間比較采用χ2檢驗(yàn)，指標(biāo)間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。構(gòu)建Kaplan-Meier曲線以確定患者總生存率(overall survival,OS)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TIMP-4和MMP-2蛋白在GC組織以及癌旁組織中的表達(dá)TIMP-4和 MMP-2和蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)，蛋白陽性表達(dá)時(shí)染色呈棕黃色顆粒(圖1)。75例GC組織中，65例(86.67%)TIMP-4蛋白陽性表達(dá)，有68例(90.67%)MMP-2蛋白表達(dá)為陽性；而在42例癌旁組織中，僅22例(52.38%)TIMP-4陽性表達(dá)，23例(54.76%)MMP-2蛋白表達(dá)為陽性。TIMP-4蛋白與MMP-2蛋白在胃癌組織表達(dá)均較癌旁組織中高且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表1)。

圖1 胃癌組織與癌旁組織中TIMP-4和MMP-2免疫組化結(jié)果 En Vision法×200

2.2 TIMP-4和MMP-2蛋白在GC患者中的表達(dá)與相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系在胃癌患者中，TIMP-4蛋白表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度及分期均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MMP-2蛋白的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌分期相關(guān)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；但與性別、年齡、腫瘤大小以及分化程度無相關(guān)性，見表2。

表1 TIMP-4蛋白和MMP-2蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)(n)

表2 TIMP-4和MMP-2蛋白表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 GC組織中TIMP-4和MMP-2表達(dá)的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析表明，在75例GC組織中TIMP-4和MMP-2表達(dá)水平呈正相關(guān)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.351,P<0.001)。

2.4 TIMP-4和MMP-2 Kaplan-Meier生存分析和臨床表達(dá)分析使用在線生物信息學(xué)工具Kaplan-Meier繪圖儀檢索，結(jié)果顯示TIMP-4、MMP-2高表達(dá)的胃癌患者OS降低(圖2)。

3 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，胃癌是全球最常見的第五種癌癥和第三大癌癥死亡原因[1-2]。在我國胃癌死亡率居全國第二，由于缺乏特異性的早期篩查和診斷方法，大量胃癌患者在初診時(shí)已進(jìn)展到晚期，預(yù)后較差，5年生存率不超過25%[8]。胃癌作為最常見的惡性腫瘤之一，早期診斷和治療已成為一個(gè)亟待解決的問題。研究[9]表明幽門螺桿菌感染、細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期功能障礙、血管生成細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移等一系列復(fù)雜的分子生物學(xué)過程參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因[10]。然而，胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不完全清楚。因此，有必要對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為進(jìn)行研究，為制定最有效的個(gè)體化治療方案，提高臨床療效提供理論依據(jù)。

TIMP-4是一種抑制金屬蛋白酶活性的蛋白質(zhì)，通過有效抑制MT1MMP介導(dǎo)的活化來調(diào)節(jié)明膠酶A的活性。有研究[11]表明TIMP-4在乳腺癌中高表達(dá)能夠抑制腫瘤生長、在子宮內(nèi)膜癌中TIMP-4過表達(dá)與侵襲有關(guān)、而在宮頸癌中TIMP-4高表達(dá)與疾病晚期相關(guān)。然而TIMP-4在胃癌中的作用仍未見報(bào)道。蛋白水解酶在細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中起著關(guān)鍵的作用，MMPs是一種重要的蛋白水解酶[12-13]。MMP-2作為MMPs家族的重要成員，在胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤分期、淋巴浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)[14-15]。

圖2 基于TIMP-4、MMP-2的總生存期Kaplan-Meier生存曲線

本研究分析了75例胃癌組織及42例癌旁組織中MMP-2蛋白和TIMP-4蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示90.67%的胃癌組織中MMP-2蛋白陽性表達(dá)，并且MMP-2蛋白高表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.001),同時(shí)與胃癌分期存在一定統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，這與前人的研究[9]是一致的，說明MMP-2可以作為預(yù)測胃癌預(yù)后的潛在標(biāo)志物；75例胃癌組織中TIMP-4蛋白的陽性表達(dá)率為86.67%，高于癌旁組織，但與胃癌轉(zhuǎn)移、分期和分化程度等無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。說明TIMP-4可能作為胃癌早期診斷的標(biāo)志物。Spearman相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中MMP-2蛋白表達(dá)水平與TIMP-4蛋白表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性且呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.351,P<0.001)，說明聯(lián)合檢測 MMP-2與TIMP-4這兩項(xiàng)指標(biāo)更有助于胃癌患者的診斷及預(yù)后評(píng)估。同時(shí)Kaplan-Meier生存分析驗(yàn)證了腫瘤患者中MMP-2、TIMP-4高表達(dá)，并預(yù)示著更短的總生存期(P<0.05)。

綜上，MMP-2與TIMP-4在胃癌組織中高表達(dá)，且其高表達(dá)均提示胃癌患者預(yù)后較差，可作為胃癌診斷和預(yù)后的潛在標(biāo)志物。