汪自然，馬 凡，丁篷生，馬筱玲

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床上尤為常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因中排名第二位[1]。雖然近年來(lái)HCC的診療水平已有了較大程度提升，但臨床療效依舊不理想，晚期HCC患者的5年生存率仍舊處于較低水平。因此，尋找新的靶向治療藥物對(duì)于降低HCC的死亡率意義重大。LukS-PV是金黃色葡萄球菌分泌的一種毒素—?dú)准?xì)胞素(Panton-Valetine leukocidin , PVL)中的S組分。課題組前期研究[2]表明，LukS-PV靶向C5aR誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株THP-1凋亡。最近研究[3]表明，LukS-PV能夠抑制乳腺癌細(xì)胞株MAD-MB-231增殖，促進(jìn)其凋亡，并誘導(dǎo)其周期阻滯。目前，LukS-PV對(duì)HCC細(xì)胞的影響及作用機(jī)制仍不清楚。組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 3, HDAC3)是一種在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)的Ⅰ類組蛋白去乙酰化酶[4]。HDAC3能夠通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄催化組蛋白的去乙?；⑴c肝臟的各種生物代謝過(guò)程[5]。該研究首先研究LukS-PV對(duì)HCC細(xì)胞增殖的作用，進(jìn)一步檢測(cè)泛乙酰化水平改變以及使用定量蛋白組學(xué)測(cè)序，初步探討LukS-PV對(duì)HCC細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料人HCC細(xì)胞株HepG2和Huh7購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)于以色列BI公司；青-鏈霉素、胰酶、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司；CCK-8試劑購(gòu)于合肥睿捷生物科技公司；Opti-MEM、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；HDAC3干擾序列由上海吉瑪公司合成；逆轉(zhuǎn)錄酶和SYBR試劑購(gòu)于日本TaKaRa公司；HDAC3、GAPDH引物由安徽通用生物公司合成；一抗HDAC3、GAPDH抗體購(gòu)于武漢三鷹生物公司；一抗泛乙?；贵w購(gòu)于杭州景杰生物科技有限公司；二抗(羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG)購(gòu)于武漢Abclonal公司；SDS-PAGE配膠試劑盒、快速封閉液、化學(xué)發(fā)光液ECL購(gòu)于上海雅酶生物公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HCC細(xì)胞株HepG2、Huh7在添加了10%胎牛血清、100 U/ml青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2LukS-PV的制備 LukS-PV按照常文嬌等[6]提供的方法表達(dá)、純化，并進(jìn)行蛋白定量。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、Huh7細(xì)胞計(jì)數(shù)，按4 000個(gè)/孔鋪于96孔中，過(guò)夜貼壁后加入不同濃度(0.25、0.5、0.75、1 μmol/L)的LukS-PV處理，分別在處理后12、24、36 h每孔加入10 μl的CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)每孔在450 nm處的吸光度(optical density,OD)。每組分別設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白孔。按照細(xì)胞存活率=OD(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/OD(對(duì)照組-空白組)×100%公式計(jì)算評(píng)估各組細(xì)胞增殖能力。

1.2.4定量蛋白組學(xué) 定量蛋白組學(xué)由杭州景杰生物科技有限公司完成。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞分為2組進(jìn)行培養(yǎng)，一組加入0.5 μmol/L的LukS-PV，另外一組加入等量的PBS作為對(duì)照。培養(yǎng)24 h后離心收集細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，加入裂解液超聲裂解，4 ℃、12 000 r/min離心15 min留取上清液并使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。酶解后的肽段采用TMT標(biāo)記并使用高ph反向HPLC分級(jí)，處理后的肽段再采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)最后使用 Maxquant (v1.5.2.8)進(jìn)行檢索并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.5TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析HDAC3在HCC中的作用 使用UALCAN網(wǎng)站分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HDAC3基因在HCC組織及正常肝組織中的表達(dá)差異以及高表達(dá)和低表達(dá)HDAC3患者的預(yù)后差異。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR) 提取細(xì)胞RNA,并對(duì)RNA濃度進(jìn)行定量，RNA純度OD260/OD280需在1.8～2.0之間方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按逆轉(zhuǎn)錄酶2 μl，RNA 500 ng，總體系10 μl進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為37 ℃、15 min，85 ℃、 5 s。PCR定量使用羅氏480儀器，PCR體系為TB 10 μl, ddH2O 7.2 μl，上下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；PCR擴(kuò)增95 ℃、 5 s，60 ℃、 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)；融解曲線分析95 ℃、 5 s，60 ℃、 1 min。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算HDAC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7Western blot分析蛋白表達(dá)量 預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次，加入蛋白裂解液冰上放置15 min，使用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮至一側(cè)后繼續(xù)置于冰上裂解20 min，期間多次吹打細(xì)胞與裂解液使其充分混勻。4 ℃、12 000 r/min離心20 min后留取上清液使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。獲得的蛋白樣本使用10%的SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)至NC膜上，轉(zhuǎn)膜條件為200 mA，90 min。使用雅酶快速封閉液室溫封閉30 min后，分別放入一抗HDAC3、GAPDH和泛乙酰化抗體(1 ∶1 000)中4 ℃搖晃孵育過(guò)夜。次日，使用TBST洗去未結(jié)合的一抗，加入羊抗鼠或者羊抗兔IgG的二抗(1 ∶5 000)中，室溫孵育2 h，TBST洗去未結(jié)合的二抗。最后使用ECL顯影液于天能曝光儀中顯影。

1.2.8細(xì)胞轉(zhuǎn)染 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和Huh7細(xì)胞鋪于6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～70%時(shí)轉(zhuǎn)染。分別取5 μl的SiRNA和5 μl的Lipofectamine2000輕輕加入125 μl的Opti-MEM中，室溫靜置5 min后將二者混合繼續(xù)室溫孵育20 min。期間將各孔培養(yǎng)液更換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，并將上述混合物加入各組細(xì)胞中。培養(yǎng)箱中孵育6 h后將培養(yǎng)液更換為含10%血清的完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。提取細(xì)胞檢測(cè)HDAC3 mRNA和蛋白表達(dá)量確定敲低效率較高后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LukS-PV對(duì)HepG2和Huh7細(xì)胞增殖的影響采用不同濃度的LukS-PV作用HepG2和Huh7細(xì)胞，并使用CCK-8方法于12、24、36 h檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的改變。結(jié)果顯示隨著LukS-PV濃度的增加，細(xì)胞抑制率逐漸增高，且細(xì)胞抑制率隨著作用時(shí)間延續(xù)增加更為明顯，表明LukS-PV可以降低HCC細(xì)胞的增殖能力且呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性。見圖1。

2.2 定量蛋白組學(xué)表明LukS-PV作用后HDAC3下調(diào)蛋白翻譯后修飾在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。近年來(lái)，乙酰化作為一種常見的表觀遺傳學(xué)修飾在腫瘤中的作用引起了廣泛的關(guān)注。為了探究LukS-PV抑制HCC細(xì)胞增殖的機(jī)制，首先使用泛乙酰化抗體檢測(cè)LukS-PV作用后總體乙?；降母淖?。結(jié)果顯示，0.5 μmol/L LukS-PV作用24 h后HepG2細(xì)胞中蛋白的總體乙?；脚cPBS組相比增高(圖2B)。進(jìn)一步使用定量蛋白組學(xué)分析LukS-PV作用后蛋白表達(dá)譜的改變。通過(guò)檢索定量蛋白組學(xué)結(jié)果顯示HDAC3表達(dá)下調(diào)(圖2A)。為了初步探究HDAC3在HCC中的作用，課題組分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC數(shù)據(jù)，其中HCC組織371例，正常肝組織50例。圖2C結(jié)果表明，HCC組織中HDAC3 mRNA表達(dá)水平(中位數(shù)26.146)明顯高于正常組織中HDAC3 mRNA表達(dá)水平(中位數(shù)17.996)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖2D生存分析結(jié)果進(jìn)一步表明高表達(dá)HDAC3的患者生存期明顯低于低表達(dá)患者(P<0.05)。因此，HDAC3可能是HCC中的一個(gè)重要的致癌基因。

圖1 不同濃度LukS-PV對(duì)HCC細(xì)胞增殖的影響

圖2 HDAC3表達(dá)下調(diào)及在HCC中的作用

A:蛋白組學(xué)熱圖；B：LukS-PV作用后總體乙酰化水平改變；C：HDAC3在HCC組織和正常組織表達(dá)差異；D：高表達(dá)HDAC3和低表達(dá)HDAC3患者預(yù)后差異;marker:分子量標(biāo)準(zhǔn)

2.3 RT-PCR和Western blot驗(yàn)證HDAC3下調(diào)基于定量蛋白組學(xué)結(jié)果顯示HDAC3下調(diào)，且HDAC3在HCC組織中高表達(dá)，與患者預(yù)后密切相關(guān)，可能是LukS-PV作用的重要靶點(diǎn)。進(jìn)一步使用RT-PCR和Western blot核實(shí)不同濃度LukS-PV作用后HDAC3 mRNA水平和蛋白水平的改變。結(jié)果表明，LukS-PV在HepG2和Huh7細(xì)胞株中可以下調(diào)HDAC3的mRNA(F=14.33,P<0.05;F=12.47,P<0.05)和蛋白水平(F=33.66,P<0.05;F=57.97,P<0.05)，且呈濃度依賴性。見圖3。

2.4 HDAC3基因敲低驗(yàn)證為了探討HDAC3在HCC中的作用，實(shí)驗(yàn)使用特異性SiRNA轉(zhuǎn)染HepG2和Huh7細(xì)胞干擾HDAC3的表達(dá)，并用RT-PCR和Western blot檢測(cè)敲低效率。RT-PCR結(jié)果顯示，與NC組相比，干擾組HDAC3 mRNA表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.23,P<0.05;t=23.21,P<0.05)，見圖4A、B。進(jìn)一步使用Western blot發(fā)現(xiàn)干擾組的HDAC3的蛋白表達(dá)水平降低，見圖4C、D。

2.5 HDAC3敲低后對(duì)HCC細(xì)胞增殖的影響確定HDAC3基因干擾效率較高后，課題組進(jìn)一步探究HDAC3基因敲低對(duì)HCC細(xì)胞增殖能力的影響。圖5結(jié)果表明，敲低HDAC3后36 h開始可以降低HCC細(xì)胞HepG2和Huh7細(xì)胞的增殖能力(t=3.32,P=0.04;t=3.501,P=0.02)。

3 討論

細(xì)菌毒素因其與靶細(xì)胞結(jié)合的特異性和細(xì)胞毒性已成為抗腫瘤藥物開發(fā)的熱點(diǎn)，部分細(xì)菌毒素已應(yīng)用于臨床。例如，從白喉?xiàng)U菌中提取的白喉毒素，在各種臨床試驗(yàn)中顯示出抗腫瘤活性，包括腎上腺皮質(zhì)癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、乳腺癌和宮頸腺癌[7-8]。課題組前期研究[2-3]表明，LukS-PV對(duì)白血病細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞均展現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用。進(jìn)一步研究[9]發(fā)現(xiàn)，LukS-PV靶向C5aR誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。而Hu et al[10]報(bào)道，C5aR在HCC中高表達(dá)，且C5aR刺激后能激活ERK1/2通路，促進(jìn)HCC的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，課題組推測(cè)LukS-PV可能對(duì)高表達(dá)C5aR的HCC細(xì)胞也有作用。

圖3 不同濃度LukS-PV下調(diào)HDAC3表達(dá)

A、B：RT-PCR檢測(cè)不同濃度LukS-PV作用HepG2與Huh7細(xì)胞后HDAC3 mRNA表達(dá)改變；C、D：Western blot檢測(cè)不同濃度LukS-PV作用HepG2與Huh7細(xì)胞后HDAC3蛋白表達(dá)改變；與PBS組比較：*P<0.05

圖4 HDAC3基因敲低驗(yàn)證

A、B:RT-PCR檢測(cè)HepG2與Huh7細(xì)胞敲低HDAC3后HDAC3 mRNA表達(dá)量改變；C、D:Western blot檢測(cè)HepG2與Huh7細(xì)胞敲低HDAC3后HDAC3 蛋白表達(dá)量改變；與NC組比較：*P<0.05

圖5 HDAC3敲低后對(duì)HCC細(xì)胞增殖能力的影響

A:HepG2細(xì)胞；B:Huh7細(xì)胞；與NC組比較：*P<0.05

近年來(lái)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用的表觀遺傳調(diào)控異常逐漸引起關(guān)注。乙?；绕涫墙M蛋白乙酰化，通過(guò)調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、凋亡和分化。而組蛋白的乙?；饕芙M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；刚{(diào)控。HDAC3作為組蛋白去乙?；易?HDACs)中的重要成員，已有多項(xiàng)研究[11-13]表明其參與HCC的發(fā)生發(fā)展。朱柯亭 等[11]報(bào)道，HDAC3在HCC組織中表達(dá)上調(diào)，能夠通過(guò)上調(diào)p-STAT3促進(jìn)HCC的復(fù)發(fā)。Wu et al[12]報(bào)道HDAC3可以與TRAF6結(jié)合增加致癌基因c-myc的穩(wěn)定性，促進(jìn)其表達(dá)。李瑞寶 等[13]報(bào)道，伏立諾他衍生物N25能夠通過(guò)下調(diào)HDAC3進(jìn)而誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡。因此，HDAC3可能是HCC中的一個(gè)重要致癌基因，可能成為未來(lái)HCC診療的新靶點(diǎn)。LukS-PV可抑制HDAC3表達(dá)，這種廣泛的去乙酰化作用導(dǎo)致細(xì)胞增殖作用降低，其中可能的機(jī)制較為復(fù)雜。Lou et al[14]報(bào)道HDAC3可以與人附睪蛋白4結(jié)合并活化PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。Lu et al[15]研究表明沉默HDAC3后胞質(zhì)中ac-STAT3向p-ATAT3的轉(zhuǎn)化過(guò)程被破壞，STAT3信號(hào)通路被抑制進(jìn)而抑制HCC細(xì)胞的增殖。

本研究首先研究了LukS-PV對(duì)HCC細(xì)胞增殖的影響，顯示LukS-PV能夠抑制HepG2和Huh7細(xì)胞的增殖。為了進(jìn)一步探索其機(jī)制，課題組采用泛乙?；瘷z測(cè)和定量蛋白組學(xué)研究LukS-PV作用后蛋白水平的變化。結(jié)果表明LukS-PV作用于HepG2細(xì)胞后，其蛋白整體乙酰化水平增高。定量蛋白組學(xué)研究表明HDAC3下調(diào)，與乙?；綑z測(cè)結(jié)果相一致。通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC數(shù)據(jù)的分析，顯示HDAC3在HCC中高表達(dá)，且高表達(dá)HDAC3的患者預(yù)后不良，表明HDAC3可能是HCC發(fā)生發(fā)展中的重要致癌基因，其功能可以進(jìn)一步研究。課題組使用RT-PCR和Western blot驗(yàn)證了蛋白組學(xué)的結(jié)果，LukS-PV可以下調(diào)HDAC3的表達(dá)。進(jìn)一步使用特異性的SiRNA干擾HDAC3的表達(dá)后，HCC細(xì)胞HepG2和Huh7的增殖能力降低，表明HDAC3可能在HCC細(xì)胞增殖調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。因此，本研究揭示了LukS-PV可能通過(guò)下調(diào)HDAC3的表達(dá)抑制HCC細(xì)胞的增殖，為HCC的精準(zhǔn)靶向治療提供了新的研究思路。當(dāng)然，LukS-PV調(diào)控HDAC3的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。