張宸銘，劉 宇，盛 瑛，徐佰達，靳天慧，劉葉紅，馬 濤，王 倩，徐紅波，宗剛軍,

血管鈣化 (vascular calcification, VC)是動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病血管病變、血管損傷、慢性腎病和衰老等普遍存在的共同病理表現(xiàn)。主要表現(xiàn)為血管壁僵硬、順應(yīng)性降低，是心腦血管疾病高發(fā)病率和高死亡率的重要因素之一，也是動脈粥樣硬化心血管事件、腦卒中和外周血管病發(fā)生的重要標(biāo)志病變[1]。 由于VC機制復(fù)雜，目前還沒有針對性的治療手段。

近年來，有研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，生長轉(zhuǎn)化因子11(growth differentiation factor 11,GDF11)作為轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的新成員，具有逆轉(zhuǎn)小鼠因高齡化導(dǎo)致的心、腦血管疾病，保護血管內(nèi)皮的作用。VC雖發(fā)生機制復(fù)雜，但其發(fā)生機制之一為血管內(nèi)皮損傷，由此猜測GDF11或可影響VC進程。該研究擬建立SD大鼠VC模型，探討GDF11對VC的作用，旨在尋找新的VC干預(yù)靶點，為治療VC提供新的可能。

1 材料與方法

1.1 動物30只6月齡雄性SD大鼠，400～500 g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。動物分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，室溫控制在(24±2) ℃，濕度<60%，光照時間為8:00～20:00。實驗前禁食12 h，不禁水。

1.2 儀器與試劑大鼠固定板、注射器、動物灌胃器、動物解剖器材、離心機、水浴鍋、瓊脂凝膠電泳系統(tǒng)、分光光度儀、病理包埋機及切片、大鼠源r-GDF11(武漢EIAAB公司)；骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein-4，BMP4)、GDF11 ELISA試劑盒(武漢EIAAB公司)；GDF11蛋白溶媒(武漢EIAAB公司；組分：NaH2PO4、NaCl、咪唑、10%甘油、pH 8.0)；BMP4(100 μg)、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)(100 μg)、GDF11(100 μg)抗體(英國abcam公司)；β-actin抗體(50 μl，上海absin公司)；山羊抗小鼠HRP標(biāo)記二抗、羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(1 ml，上海碧云天公司)；蛋白marker(上海Thermofisher分公司)；生理鹽水、花生油、尼古丁(上海碧云天公司)；維生素D3(vitaminD3，VD3)(上海碧云天公司)；無水乙醇、組織標(biāo)本包埋盒(武漢伊艾博公司)等。

1.3 方法

1.3.1實驗動物的分組及模型制備 30只6月齡SD大鼠隨機均分為5組。在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。鈣化組予以生理鹽水(1 ml/kg)，溶媒組溶媒液(1 ml/kg)，低濃度組(5% GDF11 1 ml/kg)、中濃度組(10% GDF11 1 ml/kg)、高濃度組(20% GDF11 1 ml/kg)進行腹腔注射，每日1次，持續(xù)7周[3]。實驗第7周末，配置尼古丁·花生油懸濁液10 mg/ml(1g尼古丁攪拌融入100 ml花生油)，VD3·無水乙醇6×106U/ml，分別在實驗第7周末最后一天8:00、18:00將配置好的尼古丁·花生油懸濁液攪拌均勻，并按25ml/kg對大鼠灌胃；取冷藏的VD3·無水乙醇溶液，按0.5 ml/kg對大鼠肌注一次[4]，繼續(xù)飼養(yǎng)7周。實驗第14周末，每組SD大鼠均予以10%水合氯醛·溶液2 ml/kg腹腔注射麻醉。心臟采血獲取大鼠血液。取血之后，備皮、剖開胸腔腹腔，分離升主動脈至腹主動脈分叉處的主動脈血管。

1.3.2血液ELISA檢測 每組提取的血液放入抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，取離心后上清液，按實驗分組順序分別加入BMP4、GDF11 ELISA試劑盒中。具體操作步驟按照試劑盒說明進行。

1.3.3鈣化病理學(xué)檢測 取每組3根主動脈，在生理鹽水中去除附著的結(jié)締組織、周圍脂肪及管腔內(nèi)的殘余血液。用濾紙吸干后取主動脈弓部行橫切，弓部至胸主動脈縱切，將切好的組織放入病理組織包埋盒，常規(guī)脫水、包蠟。使用石蠟切片機將動脈蠟塊切成4 μm薄片，毛筆蘸至溫水中輕展，載玻片撈出，烘烤載玻片至石蠟溶解，依次放入二甲苯、二甲苯、無水乙醇、無水乙醇脫蠟，烘箱烘干后，在紫外燈照射下Von kossa試劑染色10 min，之后HE染色復(fù)染，具體操作步驟按照試劑盒說明進行，光學(xué)顯微鏡下觀察各組動脈鈣化程度。

1.3.4Western blot檢測 將每組剩下3根主動脈分別放入EP管中，在碎冰中使用眼科剪將組織剪成泥狀，低溫提取主動脈總蛋白，檢測BMP4(一抗1 ∶1 000)，RUNX2(一抗1 ∶1 000)，GDF11(一抗1 ∶2 000)及內(nèi)參蛋白β-actin(一抗1 ∶3 000)。于80 V恒壓電泳40 min左右待marker分開后，調(diào)至120 V恒壓電泳至上樣緩沖液脫落，350 mA恒流轉(zhuǎn)膜80 min，5% BSA封閉1 h，孵育一抗4 ℃過夜，TBST洗膜5 min’5次，二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，洗膜5 min’5次，滴加ECL曝光液進行顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度，以目的蛋白與β-actin比值表示相應(yīng)蛋白表達水平。

1.3.5免疫組化檢測 1.3.3步驟中蠟塊相同切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷、封閉、洗滌孵育過夜，復(fù)染、脫水、透明封片(抗體稀釋度分別為：BMP4 1 ∶250，RUNX2 1 ∶150，GDF11 1 ∶50，羊抗兔HRP標(biāo)記二抗1 ∶50，山羊抗小鼠HRP標(biāo)記二抗1 ∶50)。光學(xué)顯微鏡200倍下觀察目的蛋白BMP4、RUNX2、GDF11的免疫組化。

2 結(jié)果

2.1 Von kossa-HE染色觀察5組主動脈VC程度通過Von Kossa切片可見，鈣化組及溶媒組動脈中膜處有大量黑褐色鈣鹽沉積，中膜彈力纖維斷裂，縱向鈣化延伸及整根動脈標(biāo)本；低、中、高濃度組中膜鈣鹽沉積，彈力纖維斷裂情況較鈣化組及溶媒組明顯減輕，鈣鹽沉積量按低、中、高濃度依次減少，彈力纖維斷裂程度依次減弱。見圖1。

2.2 5組大鼠血清中BMP4、GDF11含量測定鈣箭頭處：鈣化組及溶媒組鈣鹽大量沉積，彈性纖維斷裂；低濃度組鈣鹽沉積，彈性纖維完整；中濃度組及高濃度組鈣鹽幾乎無沉積，彈力纖維光滑完整。

圖1 5組大鼠主動脈切片 Von kossa-HE染色 ×20

化組與溶媒組之間的血清BMP4、GDF11含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；鈣化組與低、中、高濃度組，溶媒組與低、中、高濃度組及低、中、高濃度組各組間血清BMP4、GDF11含量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨r-GDF11劑量增加，血清GDF11含量越低(見表1，因RUNX2為核蛋白，血清中無法測得，故不采用ELISA法測定)。

2.3 鈣化標(biāo)志蛋白的表達Western blot顯示，隨r-GDF11濃度增加，鈣化標(biāo)志蛋白表達降低，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。免疫組化法檢測5組大鼠主動脈BMP4、RUNX2的表達：BMP4、RUNX2在鈣化組及溶媒組表達最明顯，呈棕紅色，在r-GDF11 3組則表達較少，低、中、高濃度依次表達減少，見圖3。

2.4 GDF11的表達免疫組化法檢測5組大鼠主動脈GDF11的表達：在鈣化組及溶媒組，GDF11表達微弱，在r-GDF11 3組中表達較高，低、中、高濃度組表達依次升高，呈棕紅色。Western blot顯示，隨r-GDF11劑量的增加，血管中GDF11含量升高。

3 討論

VC是一種十分普遍的血管損傷現(xiàn)象，在包含了6 814個社區(qū)的白種人、美國黑人、西班牙人、中國人等動脈硬化研究中[2]，男性的發(fā)病率分別是70.4%、52.0%、56.6%、59.2%，女性的發(fā)病率分別是44.7%、37.0%、34.8%、41.9%，而在當(dāng)時沒有發(fā)生動脈鈣化的人里，后3年隨訪內(nèi)有18%的人相繼發(fā)生鈣化。盡管進行了大量的VC研究，目前仍沒有針對VC的有效干預(yù)靶點。

表1 ELISA法測5組血清GDF11、BMP4含量比較

與鈣化組比較：□P<0.05；與溶媒組比較：#P<0.05；與低濃度組比較：△P<0.05；與中濃度組比較：☆P<0.05

圖3 不同濃度r-GDF11的鈣化標(biāo)志蛋白及GDF11的免疫組化 ×200

隨著TGF-β超家族的不斷深入研究，已有實驗[3]證實GDF11具有減輕動脈內(nèi)膜的損傷，維持粥樣斑塊穩(wěn)定、抑制骨質(zhì)形成的作用。動脈鈣化與粥樣硬化在致病因素、發(fā)病機制、形成過程中具有諸多相似之處。Mei et al[3]的研究發(fā)現(xiàn)，外源性注射r-GDF11或腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)上調(diào)GDF11的表達能夠抑制血管內(nèi)皮去分化，減少內(nèi)皮細胞的凋亡及炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定粥樣硬化的脂質(zhì)池以及維持彈力纖維的形態(tài)；在Lu et al[5]的研究中顯示，r-GDF11可以在骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)通過活化Smad2/3來抑制骨的形成。本實驗在對大鼠腹腔注射不同劑量的r-GDF11的基礎(chǔ)上，通過肌注VD3和尼古丁灌胃誘導(dǎo)SD大鼠鈣化顯示，r-GDF11組較鈣化組及溶媒組的動脈鈣鹽沉積減少，動脈中膜彈力纖維保持完整，鈣化標(biāo)志蛋白表達降低，r-GDF11組與鈣化組及溶媒組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明r-GDF11在一定程度上減弱的VC的程度，但其機制并沒有完全闡明。VC的形成是多因素參與的結(jié)果，包括細胞的凋亡與自噬、炎癥細胞的活化與遷移、平滑肌細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化等。有研究[6]發(fā)現(xiàn)通過抑制Caspase-3可以減輕細胞鈣化；Mei et al[3]已發(fā)現(xiàn)GDF11可以通過活化TGF-β/Smad2/3，AMPK/eNOS信號通路，抑制JNK和NF-κB信號通路來抑制動脈粥樣硬化的進展?？梢酝茰yGDF11的作用機制之一可能是通過活化Smad2/3信號通路來抑制Caspase-3。

在研究[7]調(diào)查中顯示，中國人血清中GDF11的含量隨年齡增長而增加，女性的血清GDF11含量要高于男性，且血清中GDF11的含量與骨質(zhì)密度呈負相關(guān)[8]；在動物研究[9]中發(fā)現(xiàn)，多種哺乳動物血清中GDF11的含量隨年齡的增大而升高；而Glass[10]的研究證實，血清GDF11的升高是評估人類疾病的風(fēng)險因素。本實驗通過ELISA檢測血清GDF11顯示，血清中GDF11的含量與鈣化程度有關(guān)，鈣化組及溶媒組的血清GDF11含量較r-GDF11組明顯升高，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)差異，可以說明鈣化程度越嚴(yán)重，血清GDF11含量越高。然而本實驗通過外源性注射r-GDF11減輕血管鈣化，血清中GDF11含量卻隨r-GDF11劑量的增加而減少，推測注射的r-GDF11可能集中于血管損傷處活化相關(guān)通路，參與內(nèi)皮及中膜的修復(fù)，導(dǎo)致血清中游離的GDF11含量下降。

GDF11目前在心血管領(lǐng)域中已有多個成果，但沒有與血管鈣化有所相關(guān)的動物或細胞實驗。而本實驗在動物上探究了外源性予以r-GDF11與動脈血管鈣化之間的關(guān)系，完善了GDF11在心血管領(lǐng)域的作用，為臨床的VC治療提供了一個新的方向。而如想將GDF11作為干預(yù)或治療VC的手段，需要更進一步分子機制研究。