崔勤濤，王俊華，劉曉晨，王學(xué)惠，馬海英，蘇國寶

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI)是心肌在缺血性損傷之后，恢復(fù)血液流通進(jìn)一步造成更為嚴(yán)重的二次損傷的過程。常常導(dǎo)致心肌代謝紊亂和結(jié)構(gòu)損傷，具有較高的死亡率和致殘率。MIRI有著復(fù)雜的病理生理學(xué)機(jī)制，涉及諸如活性氧多度產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)、鈣超載、線粒體紊亂等一系列病理變化，氧化應(yīng)激在其中扮演著最為重要的角色[1]。大黃素是傳統(tǒng)中藥大黃的提取物，是一種蒽醌類衍生物，具有抗感染、免疫調(diào)節(jié)以及抗氧化等藥理作用[2]。研究[3]表明，大黃素在大鼠MIRI中具有保護(hù)作用，然而對其保護(hù)作用機(jī)制的研究報(bào)道還有很多空缺?，F(xiàn)通過建立心肌缺血再灌注大鼠模型，探討在MIRI大鼠心肌中大黃素對Nrf2/ARE/HO-1信號通路的激活作用及其對MIRI的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑大黃素、辛伐他汀購自北京索萊寶科技有限公司；ML385購自美國Selleck有限公司；NBT染色液、HE染色液、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、DAB顯色液、ECL顯色液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒購自南京建成生物研究所；裂解型半胱天冬酶3(cleaved Caspase-3)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2, Nrf2)、血紅素氧化酶1(heme oxygenase 1, HO-1)一抗購及對應(yīng)的二抗購自美國Santa Cruz公司；動物人工呼吸機(jī)ALC-V108購自上海奧爾科特生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)動物心電圖及購自上海精密儀器科學(xué)有限公司；全自動生化分析儀購自日本日立公司；HT7700透射電鏡購自日本hitachi公司；超波切片機(jī)購自德國徠卡公司；凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組處理80只(體質(zhì)量200～250 g)健康雄性SD大鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，恒溫恒濕，明暗12 h交替的環(huán)境下在本院實(shí)驗(yàn)動物中心喂養(yǎng)1周。48只大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、MIRI模型組、辛伐他汀40 mg/kg組、大黃素20、40、60 mg/kg組；假手術(shù)組和MIRI模型組大鼠每日采用等量生理鹽水灌胃，辛伐他汀40 mg/kg組采用40 mg/kg辛伐他汀灌胃作為陽性對照，大黃素20、40、60 mg/kg組每日采用對應(yīng)劑量的大黃素進(jìn)行灌胃，灌胃每天給藥1次，連續(xù)10 d，建模前大鼠禁食禁水12 h，在最后1次灌胃45 min后建立大鼠MIRI模型。此外，另設(shè)32只大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、MIRI模型組、大黃素處理組、大黃素+ML385處理組；假手術(shù)組、MIRI模型組按照前述對應(yīng)組別處理方法進(jìn)行處理，大黃素處理組按照前述大黃素60 mg/kg組的處理方法進(jìn)行處理，大黃素+ML385處理組在大黃素60 mg/kg組處理方法的基礎(chǔ)上，在建模前的1 h腹腔注射30 mg/kg的Nrf2抑制劑ML385進(jìn)行處理。

1.3 MIRI模型建立采用結(jié)扎冠狀動脈前降支法建立MIRI模型，大鼠通過4%水合氯醛腹腔注射麻醉后打開胸腔，剪開心包，暴露心臟，其中假手術(shù)組不進(jìn)行結(jié)扎處理，其余各組于大鼠左冠狀動脈前降支起始段2 mm處穿線進(jìn)行結(jié)扎，以心肌顏色從紅色變成灰白色，并且心電圖ST段明顯抬高作為結(jié)扎成功的標(biāo)志，結(jié)扎30 min后，松開結(jié)扎線恢復(fù)血流，造成缺血再灌注，再灌注持續(xù)2 h后，處死大鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 心功能檢測麻醉的大鼠固定后，經(jīng)右側(cè)頸動脈插管至左心室，連接心電圖，檢測大鼠左心室舒張末期壓(LVEDP)、左心室收縮壓(LVSP)、左室內(nèi)壓力變化最大上升/下降速率(±dp/dtmax)。

1.5 心肌梗死面積檢測取大鼠心臟，4 ℃生理鹽水清洗3次后稱重，將心室肌切片，0.125% NBT染色液染色15 min，梗死區(qū)域?yàn)榛野咨枪Ｋ绤^(qū)域?yàn)榘底仙?，將梗死區(qū)心肌剪下稱重，心肌梗死面積通過梗死區(qū)心肌重要占全心肌重量的百分比來表示。

1.6 心肌損傷標(biāo)志物檢測再灌注2 h后，抽取頸動脈血6 ml，靜置30 min，離心分離血清，-80 ℃冰箱中保存血清，采用全自動生化分析儀檢測肌酸激酶(creatine kinase, CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogegnase, LDH)和肌鈣蛋白(troponin, cTnI)濃度。

1.7 HE染色檢測心肌組織病理性改變4%多聚甲醛固定心肌組織24 h，通過乙醇梯度脫水30 min后，二甲苯透明處理，石蠟包埋切至2 μm薄片， HE染色液進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.8 免疫組化檢測cleaved Caspase-3陽性細(xì)胞率心肌組織石蠟包埋切片后，60 ℃恒溫箱烘烤2 h，通過二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化切片，3%過氧化氫消除內(nèi)源過氧化物酶活性，清洗后PBS緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，山羊血清封閉15 min，滴加cleaved Caspase-3一抗4 ℃孵育過夜，PBS清洗后加入二抗室溫孵育2 h，PBS清洗后通過DAB顯色液進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染，清洗之后進(jìn)行脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，Image Plus圖像分析軟件分析陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞率 = 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.9 氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測取心肌組織，洗滌后在冰冷的磷酸鉀緩沖液中勻漿處理，離心取上清液，采用對應(yīng)的試劑盒進(jìn)行檢測MPO、MDA和SOD在組織中含量。

1.10 Western blot檢測蛋白表達(dá)取心肌組織，通過RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒對各組總蛋白進(jìn)行定量，通過上樣緩沖液沸水浴10 min，每組各取20 μg總蛋白進(jìn)行上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，棄殘液，1 ∶1 000 cleaved Caspase-3一抗4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液清洗后加入1 ∶200辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗室溫孵育2 h，通過ECL顯色液進(jìn)行顯影，凝膠成像儀掃描灰度值進(jìn)行相對定量。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對大鼠心臟功能的保護(hù)作用如表1所示，與假手術(shù)組比較，MIRI模型組心功能指標(biāo)LVEDP升高(P<0.01)，同時LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MIRI模型組比較，辛伐他汀40 mg/kg組LVEDP降低(P<0.01)，LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；大黃素40、60 mg/kg組LVEDP降低(P<0.05，P<0.01)，LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高(P<0.05，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 大黃素減輕MIRI大鼠心肌損傷如表2所示，與假手術(shù)組比較，MIRI模型組心肌梗死面積、CK、LDH和cTnI濃度均升高(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MIRI模型組比較，辛伐他汀40 mg/kg組心肌梗死面積、CK、LDH和cTnI濃度降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；大黃素40 、60 mg/kg組心肌梗死面積、CK、LDH和cTnI濃度降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 大鼠心臟功能指標(biāo)檢測

與假手術(shù)組比較:**P<0.01；與MIRI模型組比較:#P<0.05，##P<0.01

表2 大鼠心肌損傷指標(biāo)檢測

與假手術(shù)組比較：***P<0.001；與MIRI模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.3 大黃素減輕MIRI大鼠心肌組織病理變化如圖1所示，假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，無纖維結(jié)構(gòu)改變；MIRI模型組心肌纖維紊亂，出現(xiàn)肌絲溶解，空泡變性等病理變化；辛伐他汀40 mg/kg組和大黃素40、60 mg/kg組病理變化較MIRI模型組得到明顯改善。

圖1 HE染色檢測大鼠心肌組織病理變化 ×400

A：假手術(shù)組；B：MIRI模型組；C：辛伐他汀40 mg/kg組；D：大黃素20 mg/kg；E：大黃素40 mg/kg；F：大黃素60 mg/kg

2.4 大黃素減輕MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡如圖2所示，與假手術(shù)組比較，MIRI模型組心肌cleaved Caspase-3陽性細(xì)胞率增加(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MIRI模型組比較，辛伐他汀40 mg/kg組陽性細(xì)胞率減少(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；大黃素20 、40 、60 mg/kg組陽性細(xì)胞率減少(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 大黃素減輕MIRI大鼠氧化應(yīng)激水平如表3所示，與假手術(shù)組比較，MIRI模型組大鼠心肌組織中MPO、MDA含量升高(P<0.01)，同時SOD含量降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MIRI模型組比較，辛伐他汀40 mg/kg組大鼠心肌組織中MPO、MDA含量降低(P<0.01)，SOD含量升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；大黃素40 、60 mg/kg組大鼠心肌組織MPO、MDA含量降低(P<0.01)，SOD含量升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 大鼠心肌組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測

與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與MIRI模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖2 免疫組化檢測大鼠心肌組織cleaved Caspase-3陽性細(xì)胞率 ×400

a：假手術(shù)組；b：MIRI模型組；c：辛伐他汀40 mg/kg組；d：大黃素20 mg/kg組；e：大黃素40 mg/kg組；f：大黃素60 mg/kg組；與假手術(shù)組比較：***P<0.001；與MIRI模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.6 大黃素促進(jìn)Nrf2/ARE/HO-1信號通路激活如圖3所示，與假手術(shù)組比較，MIRI模型組大鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白水平升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MIRI模型組比較，辛伐他汀40 mg/kg組大鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白水平進(jìn)一步升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；大黃素40 、60 mg/kg組Nrf2和HO-1蛋白水平升高(P<0.05，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 ML385抑制大黃素對Nrf2/ARE/HO-1信號通路的激活作用如圖4所示，與假手術(shù)組比較，MIRI模型組大鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白水平升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MIRI模型組比較，大黃素處理組大鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白水平進(jìn)一步升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與大黃素處理組比較，大黃素+ML385處理組心肌組織Nrf2和HO-1蛋白水平降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 Western blot檢測大鼠心肌組織Nrf2/ARE/HO-1通路蛋白表達(dá)

a：假手術(shù)組；b：MIRI模型組；c：辛伐他汀40 mg/kg組；d：大黃素20 mg/kg組；e：大黃素40 mg/kg組；f：大黃素60 mg/kg組；與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與MIRI模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

a：假手術(shù)組；b：MIRI模型組；c：大黃素處理組；d：大黃素+ML385處理組； 與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與MIRI模型組比較：##P<0.01；與大黃素處理組比較：&&P<0.01

表4 ML385處理大鼠心功能及心肌損傷標(biāo)志物檢測

與假手術(shù)組比較：**P<0.01，***P<0.001；與MIRI模型組比較：##P<0.01；與大黃素處理組比較：&&P<0.01

2.8 ML385抑制大黃素對心肌的保護(hù)作用如表4所示，與假手術(shù)組比較，MIRI模型組大鼠心功能指標(biāo)LVEDP升高(P<0.01)，LVSP降低(P<0.01)，同時血清中CK和LDH濃度升高(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MIRI模型組比較，大黃素處理組大鼠LVEDP降低(P<0.01)，LVSP升高(P<0.01)，并且血清CK和LDH濃度降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與大黃素處理組比較，大黃素+ML385處理組大鼠LVEDP升高(P<0.01)，LVSP降低(P<0.01)，而血清CK和LDH濃度升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.9 ML385抑制大黃素對減輕病理改變的作用如圖5所示，假手術(shù)組、MIRI模型組以及大黃素處理組的病理變化均與之前的結(jié)果一致，相比于大黃素處理組，經(jīng)過ML385處理的大黃素+ML385組出現(xiàn)明顯的心肌纖維紊亂，肌絲溶解，空泡變性等病理變化。

圖5 HE染色檢測ML385處理大鼠心肌組織病理變化 ×400

a：假手術(shù)組；b：MIRI模型組；c：大黃素處理組；d：大黃素+ML385處理組

2.10 ML385抑制大黃素對氧化應(yīng)激的調(diào)控作用如表5所示，與假手術(shù)組比較，MIRI模型組大鼠心肌組織MPO升高(P<0.01)，同時氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA含量升高(P<0.01)，SOD含量降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MIRI模型組比較，大黃素處理組心肌組織MPO降低(P<0.01)，同時MDA降低(P<0.01)，SOD升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與大黃素處理組比較，大黃素+ML385處理組心肌組織MPO升高(P<0.01)，MDA升高(P<0.01)，SOD降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 ML385處理大鼠心肌組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測

與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與MIRI模型組比較：##P<0.01；與大黃素處理組比較：&&P<0.01

3 討論

MIRI是常見的臨床心臟疾病，常發(fā)生于心肌梗死以及心臟搭橋手術(shù)、心臟移植手術(shù)等手術(shù)之后，對治療的預(yù)后產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響[4]。傳統(tǒng)中藥提取成分大黃素被報(bào)道在MIRI過程中具有心肌保護(hù)作用，Du et al[5]研究表明大黃素以及石竹素預(yù)處理可增強(qiáng)線粒體抗氧化成分的產(chǎn)生而減輕MIRI造成的心肌損傷，提示大黃素的保護(hù)性作用與增強(qiáng)心肌的抗氧化能力有關(guān)[5-6]。本研究檢測了大鼠LVEDP、LVSP、±dp/dtmax等心功能指標(biāo)，顯示大黃素的處理減輕了MIRI引起的心功能紊亂。同時本研究檢測了大鼠血清中CK、LDH、cTnI等心肌損傷標(biāo)志物，表明大黃素處理減輕了MIRI造成了心肌損傷。此外通過組織病理染色發(fā)現(xiàn)，大黃素處理減輕了MIRI大鼠心肌組織發(fā)生的病理性改變，并且cleaved Caspase-3陽性細(xì)胞率降低。cleaved Caspase 3是細(xì)胞凋亡途徑中的執(zhí)行因子，其水平變化可反映出細(xì)胞凋亡發(fā)生的情況[7-8]。以上結(jié)果表明，大黃素可在MIRI過程中對大鼠心肌發(fā)揮保護(hù)性作用，與之前的研究結(jié)果一致。

氧化應(yīng)激是一種具有破壞性的生物學(xué)反應(yīng)機(jī)制，當(dāng)諸如活性氧等反應(yīng)分子過度產(chǎn)生時，動物自身清除過氧化物的能力無法及時清除活性氧，導(dǎo)致體內(nèi)的氧化和抗氧化平衡被打破，造成組織氧化損傷[9]。當(dāng)MIRI發(fā)生時，過量的活性氧由黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)、中性粒細(xì)胞異?；罨约熬€粒體呼吸鏈功能異常產(chǎn)生，造成了心肌功能損傷以及細(xì)胞死亡[10]。在氧化應(yīng)激發(fā)生時，細(xì)胞膜脂發(fā)生過氧化產(chǎn)生大量MDA，同時伴隨著抗氧化酶SOD的消耗，兩者常作為衡量氧化應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志物[11]。MPO是血紅素過氧化物酶超家族成員之一，主要由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌，中性粒細(xì)胞在MIRI病理過程中扮演著重要角色，MPO可催化產(chǎn)生一系列氧化劑，作用于很多細(xì)胞內(nèi)成分，并最終造成細(xì)胞損傷。因此MPO被認(rèn)為是心血管疾病中連接炎癥與氧化應(yīng)激的樞紐[12]。本研究顯示大黃素可提高SOD水平，同時降低MPO和MDA水平，表明大黃素對MIRI大鼠心肌保護(hù)作用是通過抑制氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的。

Nrf2是誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗氧化酶以對抗氧化應(yīng)激的最主要的轉(zhuǎn)錄因子，在非脅迫條件下，Nrf2與細(xì)胞質(zhì)中的接頭Keap1結(jié)合，此時為非活性狀態(tài)并很快發(fā)生泛素化被蛋白酶體降解。當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時，Nrf2與Keap1分離，并進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element, ARE)相互結(jié)合，激活Nrf2下游的基因表達(dá)。而HO-1則是Nrf2下游重要的對抗氧化應(yīng)激的酶類[13]。研究[14]表明Nrf2/ARE/HO-1信號通路在MIRI中對心肌發(fā)揮著重要的保護(hù)性作用，Nrf2可通過調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能、抗氧化、抗感染以及自噬等多個方面發(fā)揮心肌保護(hù)作用。盡管大黃素是否可以通過調(diào)控Nrf2/ARE/HO-1信號通路減輕MIRI心肌損傷還未見于報(bào)道，而在諸如骨肉瘤等其他疾病中發(fā)現(xiàn)的大黃素的調(diào)控作用暗示著大黃素減輕MIRI心肌損傷的作用可能與Nrf2/ARE/HO-1信號通路有關(guān)[15]。本研究顯示大黃素可在氧化應(yīng)激引起Nrf2/ARE/HO-1信號通路激活的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高通路的活化水平。通過Nrf2抑制劑對Nrf2/ARE/HO-1信號通路進(jìn)行抑制后發(fā)現(xiàn)，大黃素對心肌功能、心肌損傷、病理改變以及氧化應(yīng)激各指標(biāo)的調(diào)控作用均受到抑制。結(jié)果表明大黃素對MIRI大鼠心肌保護(hù)作用與Nrf2/ARE/HO-1信號通路的激活有關(guān)。

綜上所述，大黃素可通過激活Nrf2/ARE/HO-1信號通路，提高HO-1等抗氧化應(yīng)激基因的表達(dá)，從而抑制氧化應(yīng)激水平，緩解MIRI大鼠心肌損傷及功能紊亂。本研究初步探究了Nrf2/ARE/HO-1信號通路在大黃素對MIRI心肌保護(hù)中所發(fā)揮的作用，為大黃素MIRI治療的臨床應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。