高薇薇, 孫翠蘭, 郝吉慶

肺癌發(fā)病率逐年上升，已成為全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。非小細(xì)胞肺癌(non small lung cancer, NSCLC)是最常見的肺癌病理類型，約占總數(shù)的85%，而其中肺腺癌為最主要的病理類型。近年來(lái)，隨著對(duì)分子靶向藥物的深入研究，酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)類分子靶向藥物在治療表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)敏感突變的晚期肺腺癌方面取得了重大進(jìn)展，其中吉非替尼在臨床上顯著提高了肺腺癌患者的生存率。但在EGFR-TKIs治療平均9.2～14.7個(gè)月后繼發(fā)性耐藥會(huì)不可避免地發(fā)生[2]。因此，如何提高EGFR-TKIs耐藥患者的藥物敏感性是目前臨床亟待解決的難題。此外，研究[3-4]表明程序性死亡蛋白配體1(programmed death protein-ligand 1，PD-L1)高表達(dá)也與EGFR-TKIs耐藥性存在密切關(guān)系。纖維蛋白原樣蛋白1(fibrinogen-like protein 1，F(xiàn)GL1)是最新發(fā)現(xiàn)的免疫逃逸分子，在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤和結(jié)直腸癌中表達(dá)升高，其中肺癌上調(diào)百分比最高(35%)[5]，但FGL1是否參與EGFR-TKIs耐藥尚無(wú)研究。該研究觀察沉默F(xiàn)GL1對(duì)人肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞PC9/GR藥物敏感性的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌吉非替尼敏感細(xì)胞株P(guān)C9 和人肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2主要試劑和儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物公司；lipofectamineTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)Apexbio公司；Annexin V-FITC / PI細(xì)胞雙染凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物技術(shù)公司；熒光定量PCR試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；Bcl-2、Bax、Caspase-3(一抗)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；山羊抗兔多抗、山羊抗鼠多抗(二抗)購(gòu)自北京中杉金橋公司；吉非替尼購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司，按照說(shuō)明書配成濃度為10 mmol/L的溶液，分裝后存放于-20 ℃冰箱中備用。細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國(guó)SHELDON公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Tek儀器公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為英國(guó)BD Bio-sciences公司產(chǎn)品。該實(shí)驗(yàn)中使用的基因和引物序列見表1，無(wú)關(guān)的通用序列用為陰性對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將3條不同序列的siRNA隨機(jī)命名為FGL1-siRNA-1、2、3，實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組(轉(zhuǎn)染NC-siRNA)、siFGL1-1組(轉(zhuǎn)染FGL1-siRNA-1)、siFGL1-2組(轉(zhuǎn)染FGL1-siRNA-2)、siFGL1-3組(轉(zhuǎn)染FGL1-siRNA-3)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞PC9/GR，稀釋為3.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種至6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%時(shí)，換成無(wú)雙抗無(wú)血清的培養(yǎng)基，應(yīng)用lipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求操作，放于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用Western blot法和RT-qPCR法確定轉(zhuǎn)染效率。

表1 siRNA的序列及實(shí)時(shí)定量PCR目的基因的引物

1.2.2FGL1mRNA和蛋白的表達(dá)情況 應(yīng)用RT-qPCR法測(cè)定PC9組、PC9/GR組及轉(zhuǎn)染的PC9/GR-siNC、PC9/GR-siFGL1細(xì)胞中FGL1表達(dá)情況：TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得產(chǎn)物cDNA，采用Takara SYBR Green熒光定量試劑盒測(cè)定FGL1表達(dá)情況，以GAPDH為管家基因，由公式Folds=2-△△CT檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。應(yīng)用Western blot法檢測(cè)各組FGL1蛋白表達(dá)情況：收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液RIPA/PMSF(100 ∶1)將細(xì)胞重懸，冰上裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min離心30 min，取上清液，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，在SDS-PAGE凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，β-actin、FGL1、Bcl-2、Bax、Caspase-3(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠與山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)，二抗室溫孵育1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，以β-actin為內(nèi)參。

1.2.3CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖 收集PC9、PC9/GR細(xì)胞及轉(zhuǎn)染的PC9/GR-siNC、PC9/GR-siFGL1細(xì)胞，各組細(xì)胞稀釋為4×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h后，把含不同濃度梯度的吉非替尼培養(yǎng)基加入對(duì)應(yīng)各組孔中，(吉非替尼藥物濃度梯度設(shè)定：0、0.08、0.04、0.2、1、5、10、20、40 μmol/L)，培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育2 h后，酶標(biāo)儀上測(cè)吸光度(optical density,OD)450值。細(xì)胞活力值(%)=[(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%，并計(jì)算各組的IC50值。每組濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 設(shè)置PC9/GR組、PC9/GR-siNC組、吉非替尼組、PC9/GR-siFGL1組及吉非替尼+PC9/GR-siFGL1組，取6孔板作PC9/GR細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，24 h后，吉非替尼組和PC9/GR-siFGL1+吉非替尼組同時(shí)加入含有終濃度5 μmol/L吉非替尼的5%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，參考試劑盒說(shuō)明書收取細(xì)胞，2 000 r/min 離心5 min，棄上清液，用預(yù)冷的PBS(4 ℃)重懸1次，再次2 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入300 μl的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μl的Annexin V-FITC，充分混勻，室溫下避光孵育15 min，上機(jī)前5 min再加入5 μl的PI及200 μl的1× Binding Buffer，充分混勻，上機(jī)檢測(cè)凋亡率。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5Western blot測(cè)定細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4項(xiàng)。取6孔板作PC9/GR細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，24 h后，吉非替尼組和PC9/GR-siFGL1+吉非替尼組同時(shí)加入含有終濃度5 μmol/L吉非替尼的5% FBS的DMEM培養(yǎng)基，24 h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，步驟同1.2.2項(xiàng)。

2 結(jié)果

2.1 FGL1在細(xì)胞株P(guān)C9和PC9/GR細(xì)胞中表達(dá)Western blot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：PC9/GR組細(xì)胞中FGL1表達(dá)水平高于PC9組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A、B。另外，與PC9/GR-siNC組相比，PC9/GR-siFGL1-2組和PC9/GR-siFGL1-3組FGL1表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但PC9/GR-siFGL1-2組FGL1表達(dá)下調(diào)最顯著，故選取PC9/GR-siFGL1-2組的FGL1-siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1C、D。

2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同方式處理后耐藥細(xì)胞PC9/GR增殖活性CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：吉非替尼對(duì)PC9組、PC9/GR組及PC9/GR-siFGL1組細(xì)胞增殖的抑制作用均隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。PC9/GR組細(xì)胞的吉非替尼IC50高于PC9組細(xì)胞的吉非替尼IC50，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。此外，與PC9/GR組和PC9/GR-siNC組相比，PC9/GR-siFGL1組細(xì)胞的吉非替尼IC50明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，PC9/GR-siNC組與PC/GR組細(xì)胞IC50比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 Western blot實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FGL1的表達(dá)量

A: PC9組與PC9/GR組細(xì)胞中FGL1蛋白的表達(dá)；B：PC9組與PC9/GR組細(xì)胞中FGL1 mRNA的表達(dá)；C：轉(zhuǎn)染后4組細(xì)胞FGL1蛋白的表達(dá)；D：轉(zhuǎn)染后4組細(xì)胞FGL1 mRNA的表達(dá)；1：siNC；2：siFGL1-1； 3：siFGL1-2；4：siFGL1-3；與PC9組比較：**P<0.01；與siNC組比較:##P<0.01

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉默F(xiàn)GL1對(duì)PC9/GR細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞總凋亡率，PC9/GR組[(5.69±0.89)%]、PC9/GR-siNC組[(6.04±0.85)%]、吉非替尼組[(11.56±1.75)%]、PC9/GR-siFGL1組[(25.58±1.86)%]、吉非替尼+PC9/GR-siFGL1組[(35.02±2.58)%]，5組細(xì)胞總凋亡率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.711，P<0.000 1)。與PC9/GR組比較，吉非替尼組細(xì)胞總凋亡率有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而沉默F(xiàn)GL1后，PC9/GR細(xì)胞凋亡率明顯升高，聯(lián)合吉非替尼后，細(xì)胞總凋亡率最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。PC9/GR-siNC組與PC9/GR組比較，細(xì)胞總凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

2.4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Western blot法結(jié)果顯示，無(wú)活性的Caspase-3在各組細(xì)胞中表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與PC9/GR組相比，單獨(dú)應(yīng)用吉非替尼后，Bax蛋白表達(dá)有所上調(diào)、Bcl-2蛋白表達(dá)有所下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而Cleaved-Caspase-3表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而沉默F(xiàn)GL1后，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，且聯(lián)合吉非替尼后，Bcl-2下調(diào)、Bax上調(diào)更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，沉默F(xiàn)GL1后，活化的Cleaved-Caspase-3表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PC9/GR-siNC組與PC9/GR組比較，各蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

圖2 CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定吉非替尼對(duì)PC9、PC9/GR、PC9/GR-siNC和PC9/GR-siFGL1細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)

A：CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)4組細(xì)胞的細(xì)胞活力；B：4組細(xì)胞的IC50值；1：PC9組；2：PC9/GR組；3：PC9/GR-siNC組；4：PC9/GR-siFGL1組；與PC9組比較：***P<0.001；與PC9/GR-siNC組比較：###P<0.001；與PC9/GR組比較：△△△P<0.001

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率
A: PC9/GR組; B: PC9/GR-siNC組; C: 吉非替尼組; D: PC9/GR-siFGL1組; E: 吉非替尼+PC9/GR-siFGL1組

圖4 Western blot檢測(cè)各組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

A: PC9/GR組; B: PC9/GR-siNC組; C: 吉非替尼組; D: PC9/GR-siFGL1組; E: 吉非替尼+PC9/GR-siFGL1組；與PC9/GR組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與吉非替尼組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與PC9/GR-siFGL1組比較：△P<0.05

3 討論

在歐美國(guó)家中，約10%～15%的肺腺癌患者攜帶EGFR酪氨酸激酶域內(nèi)的激活突變，而在亞洲國(guó)家中，EGFR突變病例高達(dá)40%～50%[6-7]。目前，EGFR-TKIs類靶向藥物已作為晚期EGFR敏感突變的肺腺癌患者的一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案，然而，EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥的發(fā)生大大縮短了患者的生存期。研究[8]顯示繼發(fā)性耐藥機(jī)制有多種，包括T790M突變、MET基因激活、ERBB2基因擴(kuò)增、小細(xì)胞肺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等，也與PD-L1高表達(dá)相關(guān)。而FGL1與PD-L1相同，與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體相結(jié)合，從而逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視，但對(duì)FGL1是否參與吉非替尼繼發(fā)性耐藥研究較少。

FGL1在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，Zhang et al[9]研究表明在胃腺癌中，F(xiàn)GL1高表達(dá)的患者預(yù)后差，且沉默F(xiàn)GL1可抑制胃腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究顯示，與吉非替尼敏感細(xì)胞PC9相比，F(xiàn)GL1在吉非替尼耐藥細(xì)胞PC9/GR中表達(dá)明顯上調(diào)。采用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)沉默PC9/GR細(xì)胞FGL1基因，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示相比較于PC9/GR細(xì)胞和PC9/GR-siNC細(xì)胞，沉默F(xiàn)GL1基因后PC9/GR細(xì)胞的增殖能力明顯下降，表明沉默F(xiàn)GL1能夠抑制肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞PC9/GR的增殖。不同濃度的吉非替尼處理后，PC9、PC9/GR、PC9/GR-siNC、PC9/GR-siFGL1各組細(xì)胞的吉非替尼IC50分別為(0.39±0.26)、(18.18±1.26)、(16.82±0.75)、(0.94±0.25)μmol/L，表明PC9/GR細(xì)胞確實(shí)對(duì)吉非替尼耐藥，并且沉默F(xiàn)GL1的PC9/GR耐藥細(xì)胞吉非替尼IC50明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，表明沉默F(xiàn)GL1一定程度上恢復(fù)了PC9/GR對(duì)吉非替尼敏感性。

Bcl-2是Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，在乳腺癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病等多種腫瘤細(xì)胞中，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，甚至克服耐藥性[10-11]。且Zou et al[12]研究發(fā)現(xiàn)，沉默Bcl-2可提高耐吉非替尼耐藥的H1975肺癌細(xì)胞系對(duì)吉非替尼的敏感性。Bax基因是Bcl-2基因家族中一個(gè)促進(jìn)凋亡的基因，參與細(xì)胞色素C的釋放并誘導(dǎo)Caspase依賴的凋亡途徑[13-14]。本研究中，流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PC9/GR-siFGL1組細(xì)胞凋亡率增加，而吉非替尼+PC9/GR-siFGL1組PC9/GR細(xì)胞凋亡率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot結(jié)果提示沉默F(xiàn)GL1或聯(lián)合吉非替尼均能引起抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Caspase-3是細(xì)胞中一組半肽氨酸蛋白酶，同時(shí)參與內(nèi)外源性凋亡途徑。正常情況下，Caspase-3是無(wú)活性的，但在細(xì)胞接受凋亡刺激后，下游Caspases級(jí)聯(lián)激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，Caspase-3在各組細(xì)胞中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PC9/GR-siFGL1組及聯(lián)合組Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)增加，與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明沉默F(xiàn)GL1及聯(lián)合吉非替尼均能誘導(dǎo)肺腺癌耐藥細(xì)胞凋亡，且聯(lián)合處理更加促進(jìn)細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果可能是通過(guò)下述機(jī)制實(shí)現(xiàn)的：通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白表達(dá)、下調(diào)抗凋亡蛋白表達(dá)以促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致沉默F(xiàn)GL1增強(qiáng)了PC9/GR細(xì)胞吉非替尼藥物敏感性，對(duì)于沉默F(xiàn)GL1是否還存在其他恢復(fù)藥物敏感性的機(jī)制仍需深入研究。