趙 丹，李賢玉，袁美春，吳 艷，石柳柳，張志鋒

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，占全部腦卒中的20%～30%，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率的特點。然而，至今無有效治療措施[1-4]。腦血管破裂后，血液破入腦實質(zhì)，紅細(xì)胞中血紅蛋白釋放的血紅素對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，加重ICH后腦損傷[5]。E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F transcription factor 1, E2F1)是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞凋亡的核心參與者[6-7]。研究[8]提示E2F1促進(jìn)缺血性腦損傷后神經(jīng)元死亡、加重腦損傷。而E2F1在ICH中的作用尚不清楚。該實驗用血紅素處理大鼠原代皮層神經(jīng)元，模擬ICH中血紅素對神經(jīng)元的毒性作用，探索E2F1在血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中的作用及機制，以期為臨床治療ICH提供干預(yù)靶標(biāo)及實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑12只SD妊娠大鼠(體質(zhì)量300～350 g)由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實驗中心。兔抗大鼠E2F1單克隆抗體(ab179445)購自英國Abcam公司；小鼠抗大鼠NeuN單克隆抗體購自美國Millipore公司；Alexa Fluor?488標(biāo)記的驢抗鼠抗體及Alexa Fluor?546標(biāo)記的驢抗兔抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自武漢科瑞生物技術(shù)有限公司。 血紅素購自美國Sigma-Aldrich公司；MTT細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自美國Promega公司；Neurobasal及B27購自美國GIBCO公司；E2F1 siRNA及Control siRNA購自美國Santa Cruz公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；caspase活性檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜和化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Millipore公司；DMI3000B型熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 皮層神經(jīng)元分離培養(yǎng)及鑒定大鼠妊娠至17 d，4%異氟烷麻醉，頸脫臼處死。70%乙醇噴霧腹部，取出胚胎，放入冰冷的分離液中。胚胎快速斷頭，除去腦膜及血管，將皮質(zhì)置于冰冷的接種培養(yǎng)基(成份：Neurobasal，2% B27補充劑，0.5%FBS，0.5 mmol/L GlutaMAX-I 100X，25 mmol/L谷氨酸)。顯微鑷夾碎皮層組織，約為1 mm3大小，尼龍濾網(wǎng)漏斗過濾后，將皮質(zhì)神經(jīng)元懸浮在培養(yǎng)基中，并鋪在多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿上或6孔板上。第2天用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基半換液，之后每隔3 d用不含F(xiàn)BS的維持培養(yǎng)基全部換液(Neurobasal，2% B27補充劑和0.5 mmol/L L-谷氨酰胺)。 7 d后，進(jìn)行神經(jīng)元標(biāo)志蛋白NeuN熒光染色，NeuN陽性率達(dá)95%的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 血紅素處理及細(xì)胞損傷檢測提前1 d將血紅素用DMSO溶解，配制濃度為10 mmol/L 的儲存液，實驗當(dāng)天稀釋成1 mmol/L的工作液。 原代皮層神經(jīng)元以2.5×105ml的密度接種于96孔板培養(yǎng)至12 d，向培養(yǎng)液中加入不同濃度的血紅素，依據(jù)參考文獻(xiàn)[1],使終濃度分別為12.5、25、50、100、200 μmol/L，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后進(jìn)行MTT及LDH實驗。分別于490 nm和570 nm處讀取吸光度(optical density,OD)值。細(xì)胞活性計算公式：細(xì)胞生存率=(處理組值-調(diào)零孔值)/(對照孔值-調(diào)零孔值)×100%。治療組及陰性對照組則分別在神經(jīng)元中加入E2F1siRNA及Control siRNA 預(yù)處理24 h，再加入血紅素處理，12 h后進(jìn)行MTT及LDH實驗。

1.4 凋亡檢測制備TUNEL反應(yīng)混合液，50 μl TdT酶+450 μl FITC熒光素標(biāo)記液，混勻后即為TUNEL反應(yīng)混合液，處理組滴加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液于樣本上(陽性對照組先加入100 μl DNaseⅠ在15～25 ℃孵育10 min，吸水紙擦干玻片后加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液，陰性對照組僅加50 μl熒光素標(biāo)記溶液)，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI復(fù)染核。吸水紙擦干切片上液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像，凋亡細(xì)胞呈綠色熒光。

1.5 caspase活性檢測血紅素處理神經(jīng)元12 h后進(jìn)行caspase活性檢測，操作步驟按照試劑盒說明。裂解細(xì)胞后，離心收集上清液，將樣品與底物37 ℃孵育2 h，測定A570值，根據(jù)對硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品A值，計算出caspase酶活性。

1.6 免疫熒光雙染神經(jīng)元培養(yǎng)至12 d，取出含有細(xì)胞爬片的24孔板，吸出培養(yǎng)液，4% PFA 固定10 min，0.3% Triton X-100 室溫破膜8 min；無菌PBS洗2 次，每次10 min；加入5% BSA封閉液室溫封閉1 h；加入1%BSA稀釋的E2F1抗體(1 ∶200)，4 ℃冰箱過夜；次日室溫復(fù)溫5 min，吸出E2F1抗體孵育液，無菌PBS洗2次，每次10 min；加入Alexa Fluor?488標(biāo)記的驢抗鼠抗體(稀釋比例為1 ∶10 000)，室溫下避光孵育2 h 或37 ℃溫箱避光孵育1 h； 5/萬tween-20洗2次，每次10 min；0.3% Triton X-100室溫破膜8 min； 5% BSA封閉液室溫封閉30 min；加入1% BSA稀釋的NeuN抗體(1 ∶200)，37 ℃溫箱避光孵育3 h，無菌PBS 洗2次，每次10 min；加入Alexa Fluor?546標(biāo)記的驢抗兔抗體(1 ∶10 000)，室溫下避光孵育2 h或37 ℃溫箱避光孵育1 h；吸出二抗，加入5/萬tween-20 洗2 次，每次10 min；封片，共聚焦顯微鏡下拍照，處理分析照片。

1.7 Western blot檢測收集培養(yǎng)至12 d的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，蛋白變性后，采用SDS-PAGE及ECL顯色檢測蛋白水平。

1.8 細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染神經(jīng)元培養(yǎng)至12 d時，棄掉培養(yǎng)液，加入無雙抗的DMEM(含10%血清)培養(yǎng)液；將適量的Lipofectamine 2000和E2F1siRNA分別加到DMEM培養(yǎng)液中，室溫下靜置5 min； 將Lipofectamine 2000和siRNA合并混勻，靜置20 min，使Lipofectamine 2000和siRNA 能夠充分結(jié)合；將Lipofectamine 2000和siRNA 混合液以8字回旋法加入到培養(yǎng)孔中，輕輕搖晃培養(yǎng)板，放入37 ℃培養(yǎng)箱；轉(zhuǎn)染12 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液換成新的含10% 血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；24 h提取蛋白進(jìn)行Western blot檢測，鑒別轉(zhuǎn)染效果，將轉(zhuǎn)染效果最好的E2F1siRNA用于后續(xù)實驗。針對靶基因E2F1設(shè)計的siRNA候選序列為：siRNA-1: 5′-GCUAUGAGACCUCACUGAATT-3′;siRNA-2: 5′-GGACCUUCGUAGCAUUGCATT-3′; siRNA-3: 5′-CUCCCUUAAGAGCAAACAATT-3′。

2 結(jié)果

2.1 大鼠原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)鑒定鏡下可見原代皮層神經(jīng)元種植密度合適，神經(jīng)元形態(tài)良好，至第7天見明顯突起(圖1A)。NeuN免疫熒光染色陽性率達(dá)95%(圖1B)。

圖1 大鼠原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)及鑒定 ×200

2.2 血紅素誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷為了排除溶劑DMSO的影響，不同的血紅素濃度組均設(shè)置了溶劑組。結(jié)果顯示，神經(jīng)元暴露于血紅素6 h后，與溶劑組相比，損傷組LDH釋放率升高，細(xì)胞存活率降低(圖2)，提示血紅素誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元損傷。根據(jù)實驗結(jié)果，后續(xù)實驗選擇100 μmol/L作為最佳損傷濃度。

2.3 血紅素誘導(dǎo)神經(jīng)元E2F1表達(dá)上調(diào)為了判斷E2F1是否參與血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，首先檢測了E2F1蛋白表達(dá)。免疫熒光雙染顯示E2F1定位于神經(jīng)元細(xì)胞核(圖3A)。Western blot檢測結(jié)果顯示血紅素處理后神經(jīng)元E2F1表達(dá)上調(diào)(F=22.9,P<0.05)(圖3B)。

圖2 血紅素誘導(dǎo)提高皮層神經(jīng)元LDH釋放率和降低細(xì)胞生存率變化

2.4 E2F1siRNA減輕血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷為了探尋E2F1在此損傷過程的作用，將E2F1 siRNA轉(zhuǎn)入神經(jīng)元中，降低E2F1蛋白表達(dá)(圖4A)。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，治療組LDH釋放率降低(F=343.4，P<0.05)，細(xì)胞生存率升高(F=127.7，P<0.05)(圖4B)，結(jié)果提示E2F1 siRNA減輕了血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。

2.5 E2F1siRNA抑制血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡為了探尋E2F1siRNA減輕血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷機制，進(jìn)行TUNEL檢測及caspase活性檢測。TUNEL檢測結(jié)果顯示，血紅素誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡增加(損傷組vs溶劑組,F=67.2,P<0.05)，而E2F1 siRNA處理后血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡減少(治療組vs陰性對照組,F=67.2,P<0.05)(圖5A)。caspase活性檢測結(jié)果顯示血紅素處理組caspase-3(t=15.7,P<0.05)、caspase-8(t=9.7,P<0.05)、caspase-9(t=7.8,P<0.05)活性較溶劑組均升高(損傷組vs溶劑組)，而E2F1siRNA處理后caspase-3(t=8.6,P<0.05)、caspase-8(t=7.3,P<0.05)、caspase-9(t=5.7,P<0.05)活性降低(治療組vs陰性對照組)(圖5B)。結(jié)果提示，E2F1siRNA可能通過抑制血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡而發(fā)揮保護(hù)作用。

圖3 血紅素處理后神經(jīng)元E2F1表達(dá)上調(diào)

A：免疫熒光雙染檢測E2F1在神經(jīng)元中定位 ×400；1: DAPI；2: E2F1；3: NeuN；4:Merged；B：Western blot檢測血紅素處理后E2F1蛋白表達(dá)；與溶劑組比較：*P<0.05

3 討論

ICH后繼發(fā)性腦損傷是導(dǎo)致患者高死亡率和高致殘率的重要原因。ICH后，紅細(xì)胞裂解產(chǎn)生游離血紅素，導(dǎo)致一系列氧化損傷和炎癥反應(yīng)，是造成ICH后繼發(fā)性腦損傷的重要因素之一[1]。國際腦出血外科手術(shù)試驗研究對1 033 例ICH患者進(jìn)行統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，與內(nèi)科保守治療相比，發(fā)病后72 h內(nèi)實行外科血腫清除術(shù)的患者其預(yù)后無明顯改善[9]。ICH損傷機制復(fù)雜，目前除支持療法外，缺乏行之有效的治療方法，因此未來的研究應(yīng)側(cè)重于多種可能的干預(yù)靶標(biāo)。

圖4 E2F1siRNA降低皮層神經(jīng)元LDH釋放率和提高細(xì)胞生存率

A：E2F1siRNA轉(zhuǎn)入神經(jīng)元后，Western blot檢測E2F1蛋白表達(dá)；B：LDH釋放率及細(xì)胞生存率檢測細(xì)胞損傷程度；1:溶劑組；2：損傷組；3：陰性對照組；4：治療組；與陰性對照組比較：#P<0.05；與溶劑組比較：*P<0.05

據(jù)研究報道[1]ICH后紅細(xì)胞釋放的氧化形式的血紅素、氧化還原活性鐵、細(xì)胞 NADPH 和谷胱甘肽的消耗對細(xì)胞和組織帶來直接的細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而引發(fā)一系列損傷反應(yīng)，對神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞造成損傷。研究[10-11]報道，血紅素通過特定的信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，或者通過誘導(dǎo)自由基的生成而引發(fā)進(jìn)一步的脂質(zhì)過氧化，或者通過其內(nèi)的鐵原子直接參與脂質(zhì)過氧化，從而增加細(xì)胞對氧化損傷的敏感性。血紅素亦可以通過激活TLR4 通路，促使小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-6等炎癥因子，從而引起神經(jīng)炎癥，對神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷[12]。

圖5 E2F1 siRNA抑制血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡

A：TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡數(shù)量 ×100；B：caspase活性檢測；1:溶劑組；2：損傷組；3：陰性對照組；4：治療組；與溶劑組比較：*P<0.05；與陰性對照組組比較：▽P<0.05

E2F1作為細(xì)胞命運的主要調(diào)節(jié)因子，其復(fù)雜作用被廣泛研究，結(jié)果表明E2F1是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中重要的調(diào)節(jié)因子，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用越來越受到重視[6-8]。本研究首先檢測E2F1在大鼠皮層神經(jīng)元的表達(dá)，結(jié)果表明E2F1與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN具有高度重疊性，說明E2F1表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞核中，提示E2F1極有可能參與神經(jīng)元的功能調(diào)節(jié)。而對大鼠原代皮層神經(jīng)元進(jìn)行血紅素處理后，神經(jīng)元中E2F1表達(dá)升高，與最近的缺血性腦中風(fēng)研究結(jié)果相一致[13]。細(xì)胞毒性實驗結(jié)果顯示，血紅素處理組與對照組相比，LDH釋放率增加、細(xì)胞生存率降低。同時，細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示，血紅素誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡，caspase-3、caspase-8及caspase-9活性較對照組均升高。以上結(jié)果提示血紅素誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡及細(xì)胞毒性，對神經(jīng)元造成損傷。為了檢測E2F1在血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡及損傷中的作用，進(jìn)一步用E2F1 siRNA敲低神經(jīng)元E2F1表達(dá)，結(jié)果顯示E2F1 siRNA削弱了血紅素誘導(dǎo)的LDH釋放率增加及細(xì)胞生存率降低，同時減少了血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。結(jié)果提示，E2F1 siRNA減輕血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)元損傷。綜上所述，E2F1參與血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)元毒性損傷。本研究為揭示E2F1在ICH后腦損傷中的作用及發(fā)現(xiàn)治療ICH的新靶點提供了實驗依據(jù)。