張凱,李明路,董川,宋勝梅,劉洋

(山西大學(xué) 環(huán)境科學(xué)研究所,化學(xué)化工學(xué)院,山西 太原 030006)

0 引言

自從1871年Von Bayer首次合成熒光素。由于熒光素水溶性好,熒光量子產(chǎn)率高,摩爾消光系數(shù)大等較為優(yōu)異的性能,已被廣泛地作為熒光團用于各種離子的檢測和生物成像[1-2]。熒光素主要由氧雜蒽環(huán)和苯環(huán)兩部分組成,由于這兩部分獨一無二的特點,熒光素常被用作各種目標(biāo)分子的光學(xué)傳感[3-4],特別是金屬離子,如Hg2+[5]、Al3+[6-9]、Cu2+[10]等。

鋁是地殼中含量最多的金屬元素,其含量大約為8%,僅次于氧和硅。鋁的化合物和我們的生活息息相關(guān),例如食品包裝、醫(yī)藥、餐飲器具等[11-12]。然而，攝入過多的鋁會導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生,例如阿爾茲海默癥和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥等[13-14]。據(jù)報道,人平均每天攝入鋁的量約為3.0～10.0 mg,另外,人體每周攝入鋁的量在人體重的占比大約為7 mg/kg[15-16]。因此,在生物體中定量檢測Al3+是非常必要的。在各種檢測分析方法中,光學(xué)(熒光和比色)探針由于具有靈敏度高、對分析物損傷小和“裸眼”檢測等優(yōu)點而備受關(guān)注[10,17]。侯等報道了一種可選擇性檢測Al3+的比色熒光探針,其探針?biāo)雇锌怂刮灰戚^小(50 nm),另外發(fā)射波長處于藍(lán)光區(qū),背景干擾較大,會極大地限制其在生物成像的應(yīng)用[6]。對該探針的改進需要從斯托克斯位移和波長兩方面著手。

本文以熒光素為基體,通過5-硝基水楊醛與二溴熒光素酰肼縮合反應(yīng),合成了比色-熒光探針5-硝基水楊醛二溴熒光素腙(NDH),并對其結(jié)構(gòu)進行了表征。通過熒光光譜(熒光法)和紫外光譜(比色法)考察了探針NDH對常見金屬離子的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)熒光探針NDH對Al3+具有相對較高的選擇性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Hitachi U-2900紫外-可見分光光度計(日本Shimadzu);Bruker/Tensor-27紅外光譜儀(德國公司);VARIAN熒光光度計(美國公司);AVANCE-600 MHz核磁共振譜儀(德國Bruker optics公司);GZX-9246MBE鼓風(fēng)干燥箱(上海公司);PhS-3C型酸度計(德國Sartorius公司)。

二溴熒光素(C20H10Br2O5,阿拉丁試劑有限公司),水合肼(N2H4·H2O,質(zhì)量百分?jǐn)?shù)80%,天津市富宇精細(xì)化工有限公司),2-羥基-5-硝基苯甲醛(C7H5NO4,上海畢得醫(yī)藥科技有限公司),無水乙醇(體積百分?jǐn)?shù)99.7%,分析純,天津市北辰方正試劑廠),所有金屬離子等其他試劑均為分析純。實驗室用水為二次蒸餾水。

1.2 熒光探針NDH的合成步驟及路線

1.2.1 二溴熒光素酰肼的合成

參考文獻[18],將1.0 mL(20.0 mmol)水合肼加入到100 mL三口燒瓶中,然后加入20 mL甲醇溶液,攪拌均勻。另外,將溶解在10.0 mL甲醇溶液中的3.4 g二溴熒光素逐滴加入到三口燒瓶中,接著攪拌加熱回流4 h。反應(yīng)完畢后將其冷卻到室溫,然后旋蒸并真空干燥,再用甲醇溶液重結(jié)晶,干燥后得到粉色固體粉末3.89 g,產(chǎn)率82%。

1.2.2 二溴熒光素衍生物NDH的合成

稱取0.019 g(0.01 mmol)二溴熒光素酰肼于100 mL三口燒瓶中,接著加入10 mL無水乙醇,超聲大約5 min使其溶解,然后逐滴加入溶有0.007 5 g(0.02 mmol)2-羥基-5-硝基苯甲醛的10 mL無水乙醇溶液,攪拌加熱回流4 h,反應(yīng)完畢后將其冷卻到室溫,然后旋蒸并真空干燥,再用甲醇溶液重結(jié)晶,干燥后得到灰白色固體粉末0.025 g,產(chǎn)率75%(見Scheme 1,照片中A為二溴熒光素酰肼在水中的綠色熒光,照片中B為NDH在水中的黃色熒光)。

方案1 NDH的合成路線

1.3 光譜性質(zhì)的測定方法

將NDH溶于二次水中,配成1.0×10-3mol/L的儲備液,用于離子(Al3+,Ba2+,Ca2+,Hg2+,Co2+,Cu2+,Ni2+,Fe3+,Fe2+,Pb2+,Cd2+,Mn2+,Cr3+,Cr2+)選擇性測定。NDH滴定檢測Al3+的體系為THF-H2O(9∶1,V/V;pH=7.40)。滴定實驗:移取熒光探針NDH的儲備液于比色管中,并加入相應(yīng)體積的金屬離子儲備液,然后用THF-H2O(9∶1,V/V;pH=7.40)溶液定容,用于光譜的測定。熒光檢測的激發(fā)和發(fā)射狹縫分別是5和10 nm。

1.4 細(xì)胞實驗

將SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)在含10%的胎牛血清DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2(V/V)的培養(yǎng)箱中,然后將SMMC-7721細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中進行24 h的貼壁生長,并除去未貼壁的細(xì)胞。在培養(yǎng)皿中加入5.0 μmol/L的探針NDH培養(yǎng)30 min之后,用PBS緩沖清洗細(xì)胞3次,接著進行激光共聚焦成像。最后加入10.0 μmol/L的Al3+培養(yǎng)30 min后進行熒光成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 二溴熒光素衍生物NDH的表征

化合物NDH,灰白色固體粉末。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 12.23 (s, 1H), 9.97 (s, 2H), 9.11 (s, 1H), 8.72 (d, J=2.8 Hz, 1H), 8.28 (d, J=9.1 Hz, 1H), 7.99 (d, J=32.5 Hz, 1H), 7.18 (d, J=9.1 Hz, 1H), 7.00 (d, J=9.3 Hz, 1H), 6.68 (d, J=8.8 Hz, 1H), 6.43 (q, J=8.6 Hz, 4H); FT-IR (KBr), σ/cm-1: 3 423(-OH),1 631(-C=N). HRMS (ESI): calcd for C27H16Br2N3O7(NDH+H) 651.935 5, found 651.913 4.

2.2 比色法檢測Al3+

首先考察了NDH在THF-H2O(9∶1,V/V)溶液中對不同金屬離子的紫外可見吸收光譜的響應(yīng)。如圖1a所示,NDH在可見光區(qū)443 nm處有明顯的吸收,加入Al3+后,NDH在443 nm的吸收峰消失;而加入其他金屬離子后,吸收峰強度及位置幾乎保持不變(如圖1b)。由圖1插圖可見,NDH溶液的顏色由黃色變?yōu)闊o色,可以實現(xiàn)裸眼識別進而判斷鋁離子的存在。

2.3 熒光法檢測Al3+

NDH對金屬離子的熒光選擇性實驗如圖2a,2d所示,結(jié)果表明只有加入Al3+才會引起NDH在600 nm處熒光強度的改變,然而其他金屬離子對NDH的熒光強度幾乎沒有影響(圖2b),結(jié)果表明,NDH可以作為一種高選擇性的熒光-比色探針用于Al3+的檢測。另外,檢測了不同的溶劑對NDH熒光光譜的影響(圖2c),發(fā)現(xiàn)在THF中具有相對較長的發(fā)射波長。在熒光滴定中(圖2e),當(dāng)激發(fā)波長為443 nm時,NDH在600 nm處會出現(xiàn)一個明顯的發(fā)射峰,隨著逐漸增加Al3+的濃度,NDH在600 nm處的熒光發(fā)射峰強度逐漸降低。這可能是由于Al3+有一個未填充的3d外殼,可以通過電子轉(zhuǎn)移猝滅熒光[19-20];NDH對Al3+的猝滅現(xiàn)象是由于配體金屬電荷轉(zhuǎn)移(LMCT),即通過與金屬的絡(luò)合作用,熒光團到Al3+的電子轉(zhuǎn)移[21-22]。由圖2e中插圖可知,線性回歸方程為F0-F=-13.55+54.38[Al3+] (R2=0.981 5,n=14),檢測限LOD為0.01 μmol/L(信噪比為3∶1),線性范圍為0.2～5 μmol/L。另外,與其他熒光素檢測Al3+相比(見表1),結(jié)果表示本探針的檢測限相對較低,可以作為比色-熒光雙渠道探針檢測Al3+。如圖2f所示,根據(jù)Benesi-Hildebrand方程,NDH與Al3+的結(jié)合常數(shù)為Kd為2.54×105L/mol,這種較高的結(jié)合常數(shù)表明NDH在溶液中與Al3+有強的鍵合吸附能力。

2.4 時間響應(yīng)

NDH+Al3+的時間響應(yīng)如圖3所示,當(dāng)向NDH(5.0 μmol/L)中加入Al3+(5.0 μmol/L)后,NDH的熒光強度在10 s內(nèi)達(dá)到最低值,10 s以后熒光強度基本保持穩(wěn)定,而且NDH的熒光強度在10 min內(nèi)基本保持不變,表明NDH與Al3+的結(jié)合可以很快達(dá)到平衡。

表1 探針NDH與現(xiàn)有Al3+熒光探針的比較

圖1 不同金屬離子對NDH(10-5 mol/L)紫外可見吸收光譜的影響

圖2 (a)不同金屬離子(5.0 μmol/L)對NDH(5.0 μmol/L)熒光光譜的影響;(b)不同金屬離子對NDH熒光光譜影響的柱狀圖;(c)不同溶劑對NDH熒光光譜的影響;(d)Ag+對NDH(5.0 μmol/L)熒光光譜的影響;(e)Al3+(0.2～5.0 μmol/L)濃度對探針NDH(5.0 μmol/L)熒光光譜的影響;(f)NDH與Al3+結(jié)合常數(shù)的測定

2.5 NDH與Al3+的結(jié)合模式

利用等摩爾連續(xù)變化法來測定NDH與Al3+的結(jié)合比。保持NDH和Al3+的濃度和為1.0×10-5,改變NDH和Al3+的相對濃度比(9∶1,8∶2,7∶3,…,1∶9),通過紫外吸收光譜,測定了不同比例的溶液在424 nm處的吸光度值,以Al3+在二者總濃度中的占比為橫坐標(biāo),424 nm處的吸光度值為縱坐標(biāo),得到Job’s plot工作曲線,如圖4所示。結(jié)果表明NDH與Al3+形成1∶1結(jié)合物。另外,從質(zhì)譜分析結(jié)果也能得出相同結(jié)論。如圖5所示,峰值m/z 677.909 8為NDH+Al3+[calcd, m/z:677.902 8]。

2.6 細(xì)胞實驗

首先選用SMMC-7721細(xì)胞為模型,如圖6a所示,通過MTT實驗考察了NDH的細(xì)胞毒性。當(dāng)NDH的濃度為40.0μmol/L時,培養(yǎng)12h后,細(xì)胞的存活率仍有90%以上;當(dāng)NDH的濃度為60.0 μmol/L時,培養(yǎng)12 h后,細(xì)胞的存活率仍有80%以上,說明探針具有較低的毒性。在細(xì)胞中加入5.0 μmol/L的NDH,然后培養(yǎng)30 min之后,細(xì)胞中呈現(xiàn)黃色熒光(如圖6b,依次為明場圖、暗場圖、疊加圖);之后加入10 μmol/L的Al3+,細(xì)胞的黃色熒光逐漸猝滅(如圖6c,依次為明場圖、暗場圖、疊加圖)。

圖3 加入Al3+前后NDH的時間響應(yīng)

圖4 NDH與Al3+結(jié)合比的測定

圖5 NDH+Al3+的質(zhì)譜圖

圖6 (a)NDH的細(xì)胞毒性;(b)和(c)：NDH和NDH與Al3+細(xì)胞成像研究

3 結(jié)論

本文以5-硝基水楊醛與二溴熒光素酰肼為原料,合成了新型熒光探針5-硝基水楊醛二溴熒光素腙(NDH),并對其結(jié)構(gòu)進行了表征。隨著Al3+濃度的增加,NDH在600 nm處的熒光減弱,基于NDH和Al3+的絡(luò)合作用,可以實現(xiàn)對Al3+的選擇性檢測。通過等摩爾變化法,表明NDH與鋁離子形成1∶1絡(luò)合物,并且可以裸眼識別顏色的變化。所制備的探針NDH合成方法簡單、選擇性好、靈敏度高,可以實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Al3+的熒光成像。與已報道的探針相比,NDH屬于比色-熒光雙渠道探針,具有潛在的應(yīng)用價值。