駱宇璐，孟 琴

浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310058

生物表面活性劑是包含由植物、動(dòng)物和微生物合成的一類具有表面特性的兩親性分子。其中，微生物表面活性劑由于具有低毒性、可生物降解、生態(tài)安全、極低的臨界膠束濃度值（CMC）以及獨(dú)特的生物活性等特點(diǎn)，引起了廣泛的關(guān)注[1]。由于微生物表面活性劑的上述優(yōu)良特性，普遍被認(rèn)為在化妝品工業(yè)中具有極大的應(yīng)用潛力[2]。

鼠李糖脂是一種主要以銅綠假單胞菌為菌體發(fā)酵而來的生物表面活性劑[3]，表面性能良好，中性水溶液中其臨界膠束濃度為0.1 mmol/L[4-5]，比常見的化學(xué)離子表面活性劑低近1～2個(gè)數(shù)量級(jí)（如常溫下十二烷基硫酸鈉的CMC為8.1 mmol/L，月桂酸鈉的CMC為24.4 mmol/L）[6]。此外，鼠李糖脂除眼睛刺激以外，幾乎沒有皮膚刺激性，具有良好的生物相容性[7-9]。鼠李糖脂具有較優(yōu)的生物活性，據(jù)報(bào)道其可調(diào)節(jié)皮膚毛細(xì)血管擴(kuò)張治療紅血絲[10]、通過調(diào)節(jié)真皮中肥大細(xì)胞的脫粒治療皮膚過敏[11]、抑制皮膚纖維化促進(jìn)傷口愈合[12]及促細(xì)胞滲透[13]等，也有報(bào)道指出鼠李糖脂在化妝品中具有抗菌、抗皺紋和抗衰老作用[14-15]。

微乳液是一種外觀澄明、熱力學(xué)穩(wěn)定的分散體系。相比于傳統(tǒng)劑型，微乳液可改善活性成分在皮膚中的擴(kuò)散性和滲透性，提高產(chǎn)品效率和穩(wěn)定性，改善外觀[16]。以微乳液形式制備的化妝品，具有良好的化妝品特性和高水合特性，施用于皮膚后能減少刺痛和刺激，并帶來良好的膚感[17]。近年來，已有部分研究報(bào)道了以鼠李糖脂作為表面活性劑的微乳體系的構(gòu)建，但主要集中在藥物載體、生物柴油和環(huán)境修復(fù)方面[5,9]，尚未見其用于化妝品中的研究報(bào)道。

本工作旨在開發(fā)以鼠李糖脂作為表面活性劑的微乳護(hù)膚品，以期得到性能優(yōu)良且具有護(hù)膚作用的制劑，為生物表面活性劑在微乳劑型化妝品中的應(yīng)用提供必備的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 乳化能力和乳化穩(wěn)定性測定

根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法測定乳化能力（EC）和乳化穩(wěn)定性（ES）。在離心管中將2 mL鼠李糖脂溶液與2 mL油相混合，用均質(zhì)器持續(xù)劇烈攪拌120 s，重復(fù)兩次。最后將乳液在4 000r/min下離心5 min。測量乳液的總體積記為Wv，乳化層體積記為Lv。乳化能力（EC）的計(jì)算公式：

將乳液在室溫下保存7 d，然后在4 000 r/min下離心5 min，記錄重新離心后乳化層的體積（LN），將它與原乳化層體積（Lv）相比，測定鼠李糖脂的乳化穩(wěn)定性，其計(jì)算公式：

1.2 偽三元相圖的繪制

使用油滴定法來繪制鼠李糖脂微乳液的偽三元相圖。參考文獻(xiàn)[19]方法，固定助表面活性劑和表面活性劑的比（Km）為2:1，改變水對(duì)混合表面活性劑的質(zhì)量比，分別在1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2和9:1等一系列的固定質(zhì)量比下，在漩渦振蕩的同時(shí)用選定的油相進(jìn)行滴定，直到體系由渾濁變?yōu)槌吻?，或由澄清變?yōu)闇啙?，直至該狀態(tài)不再改變。通過肉眼觀察對(duì)混合物進(jìn)行定性分析：澄清、透明、黏度低且使用激光筆平行光入射后激光成束不分散的為微乳液；不透明、渾濁的乳狀液為普通乳劑。記錄發(fā)生臨界相變時(shí)的加入質(zhì)量，使用Origin 8.0繪制偽三元相圖。

1.3 微乳理化性質(zhì)的測定

在微乳區(qū)域中選取3個(gè)不同的點(diǎn)作為微乳的配方，配制3種微乳液，并按照下述方法評(píng)價(jià)其理化性質(zhì)：微乳外觀性狀評(píng)估，在室溫和非陽光直射條件下肉眼觀察所制得的微乳的澄清度和均勻度；微乳pH值測定，在室溫條件下，用pH計(jì)測定所制得微乳液的pH值，重復(fù)測試3次，記錄結(jié)果；微乳類型判斷，使用染色法判斷微乳液的類型，其中，亞甲基藍(lán)為水溶性染料，蘇丹紅為油溶性染料；微乳的黏度測定，在20 ℃的恒溫下，使用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測定制得的微乳液的黏度；微乳粒徑分布和Zeta電位，取已制備好的鼠李糖脂微乳液用純水稀釋至相同的倍數(shù)，使用納米粒度電位分析儀測定其粒徑大小和Zeta電位。

1.4 微乳精華的制備及評(píng)價(jià)

1.4.1 微乳精華的配方設(shè)計(jì)選取兩種綜合性能良好的配方作為精華微乳的基底，再添加鼠李糖和木糖醇作為肌膚調(diào)理劑，添加苯氧乙醇作為防腐劑，攪拌均勻，制備相應(yīng)的精華微乳。

1.4.2 微乳精華穩(wěn)定性分析

按照文獻(xiàn)[20]和國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 29665-2013分別評(píng)估所制備的微乳精華液的離心穩(wěn)定性、耐寒耐熱性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

1.4.3 微乳精華功效評(píng)估

選擇20～30歲無過敏史且受試部位近3個(gè)月未參加其他臨床試驗(yàn)者的女性志愿者8名，分別選取手背上固定區(qū)域，使用數(shù)字皮膚測試儀分別測試使用精華微乳前后皮膚的水分含量及皮膚彈性，評(píng)價(jià)精華微乳對(duì)皮膚狀態(tài)的改善情況，其中皮膚彈性以1～5分分別表示粗糙、偏粗糙、一般、偏柔細(xì)和柔細(xì)5種等級(jí)。

2 結(jié)果與討論

2.1 微乳的制備

2.1.1 油相的選擇

表面活性劑的乳化效果通常由兩部分綜合評(píng)價(jià)：乳化能力評(píng)估其促進(jìn)乳液形成的能力，乳化穩(wěn)定性表示乳化期間和之后其對(duì)細(xì)小液滴的穩(wěn)定能力[18]。選擇3種化妝品中常用油相角鯊?fù)?、異十六烷和荷荷巴油，測定鼠李糖脂的EC和ES，其結(jié)果見表1?？梢钥吹剑罄钐侵诓煌拖嘀械谋憩F(xiàn)力是不同的。其中在角鯊?fù)橹械娜榛Ч亲詈玫?，且乳化能力受鼠李糖脂質(zhì)量濃度影響較小。其次是異十六烷，其乳化能力隨所使用的鼠李糖脂濃度增加而增加。在荷荷巴油中鼠李糖脂的乳化效果最差。荷荷巴油實(shí)際是一種液態(tài)的植物蠟，其由多種不飽和脂肪酸與少量飽和脂肪酸組成，可能是由于荷荷巴油成分復(fù)雜導(dǎo)致乳化效果差。另有文獻(xiàn)[9]指出，鼠李糖脂在烷烴中的乳化活性隨所含碳原子數(shù)的增加和烷烴支鏈化程度的降低而增加，角鯊?fù)楹彤愂榈慕Y(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)符合該規(guī)律。結(jié)合乳化穩(wěn)定性，鼠李糖脂質(zhì)量濃度在1%～2%時(shí)，在角鯊?fù)橹械姆€(wěn)定性也優(yōu)于異十六烷和荷荷巴油，因而在后續(xù)使用鼠李糖脂配制微乳時(shí)選擇角鯊?fù)樽鳛橛拖唷?/p>

表1 鼠李糖脂的乳化能力和乳化穩(wěn)定性Table 1 Emulsifying capacity (EC) and Emulsifying stability (ES) of rhamnolipids

2.1.2 偽三元相圖的構(gòu)建

丙三醇（甘油）作為短鏈醇可以降低水油兩相間的界面張力，增加鼠李糖脂溶解性，同時(shí)用于化妝品中能起到保濕和潤膚作用[21]，因此，本工作選擇甘油作為助表面活性劑。圖1為繪制得到的鼠李糖脂-角鯊?fù)?甘油-水體系的相圖，其中B，W和O分別表示以甘油和鼠李糖脂組成的混合表面活性劑、角鯊?fù)楹退啵幱皡^(qū)域?yàn)槭罄钐侵奈⑷閰^(qū)。結(jié)果顯示，在水含量增加和表面活性劑含量較大時(shí)，能形成微乳狀液區(qū)。

圖1 鼠李糖脂微乳的偽三相圖Fig.1 Pseudo three-phase diagram of rhamnolipid microemulsion

2.1.3 微乳的制備

選取偽三相圖中微乳區(qū)的3種不同配方配制微乳液，具體配方見表2。其中配方1和配方2的混合表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)（w）相同，但配方1的角鯊?fù)橘|(zhì)量分?jǐn)?shù)高于配方2。配方2和配方3的角鯊?fù)橘|(zhì)量分?jǐn)?shù)一致，但配方2的混合表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于配方3，而水量低于配方3。將鼠李糖脂與甘油和水按照配比在60 ℃下超聲溶解均勻混合后，使用漩渦振蕩儀一邊攪拌一邊滴加角鯊?fù)椤Ｗ罱K得到均一透明的鼠李糖脂微乳液，其在4 000 r/min下高速離心10 min仍不分層。

表2 鼠李糖脂微乳液的配方Table 2 Formula of microemulsion of rhamnolipids

2.2 微乳的理化性質(zhì)

3種配方下得到的微乳液均澄清透明，呈淡黃色[（如圖（2a）]，三者均勻度良好，其中配方1得到的澄清度相對(duì)較低，配方2和配方3澄清度最佳。由表3中三者的黏度可知，在流動(dòng)性上從大到小依次為配方3，配方2，配方1。測定其pH值，三者均呈弱酸性，為6.0±0.1。使用染色法來判斷微乳液的類型，結(jié)果如圖2（b），可以看到3種配方下，均是亞甲基藍(lán)染液比蘇丹紅染液擴(kuò)散更快。由于亞甲基藍(lán)為水溶性染料而蘇丹紅為油溶性染料，說明由鼠李糖脂制備的3種配方的微乳液均為O/W型微乳液。

圖2 鼠李糖脂微乳的外觀（a）及類型判斷（b）Fig.2 The rhamnolipids microemulsion with different formula (a) and the judgement of their types (b)

粒徑和Zeta電位是考察微乳穩(wěn)定性的2個(gè)重要參數(shù)，3種不同配方的微乳制劑的粒徑分布情況與Zeta電位結(jié)果見表3。1#乳液的平均粒徑約100 nm，屬于亞微乳范疇，2#和3#乳液的平均粒徑在44 nm左右。從Zeta電位判斷可知微乳均帶負(fù)電，其中3#的帶電性最強(qiáng)，其粒子間排斥力最大，有利于提高其溶液穩(wěn)定性。兼顧2#乳液的帶電性高和粒徑小的雙重特征，其穩(wěn)定性應(yīng)該高于其它兩種乳液。另外，從表3中可以看出1#乳液的粒子聚集程度（PDI）明顯高于其它兩種乳液，這可能是由于1#乳液含較多的黏性物質(zhì)角鯊?fù)楹透视土浚黾恿巳芤旱酿ざ?，而削弱了其分子運(yùn)動(dòng)程度，造成粒徑分布不夠均勻。比較三者的配方成分，可以得出，油相的含量對(duì)微乳粒徑影響較大。當(dāng)油相含量較高時(shí)，制備得到的微乳液具有更大的粒徑分布和PDI。

表3 鼠李糖脂微乳液的理化性質(zhì)Table 3 Physical and chemical properties of rhamnolipids microemulsion

2.3 微乳精華的制備及理化性質(zhì)

根據(jù)表4的配方制備微乳精華，外觀如圖3所示。由圖可知，二者的澄清度和均勻度良好，測定其黏度可得配方1和配方2的平均黏度分別為66.3 mPa·s和58.5 mPa·s，流動(dòng)性較2.1中還有一定的提升。測驗(yàn)其pH值，二者的pH值仍在6.0左右，接近人類皮膚的pH值。

圖3 精華微乳的外觀Fig.3 The appearance of essence microemulsion

2.4 微乳精華的穩(wěn)定性分析

取制備好的兩類精華微乳制劑分別評(píng)估其離心穩(wěn)定性、耐寒耐熱性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，評(píng)估結(jié)果見表5。由表可知，兩種微乳精華在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心30 min，無分層現(xiàn)象，離心穩(wěn)定性良好。分別置微乳精華于40 ℃和-10 ℃下恒溫保存24 h后，然后存放于室溫下，發(fā)現(xiàn)該乳液無油水分層現(xiàn)象且無色澤及流動(dòng)性變化。此外，在室溫條件下儲(chǔ)存制備好的精華微乳15，30和60 d之后高速離心，同樣無油水析出且色澤/流動(dòng)性變化，符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 29665-2013的指標(biāo)。綜上，在兩種配方下得到的精華微乳，離心穩(wěn)定性、耐熱耐寒性與儲(chǔ)存穩(wěn)定性都良好。

2.5 微乳精華的功效評(píng)價(jià)

以蒸餾水作為空白組對(duì)照（記為A0），配方1和配方2的效果記為A1和A2，歐萊雅復(fù)顏抗皺緊致滋潤乳液（市售產(chǎn)品）作為陽性對(duì)照記為AP。每隔一段時(shí)間測試不同志愿者使用不同配方后所測部位的皮膚彈性和水分值，其結(jié)果如圖4所示，其中圖4（a）中A1和A2的曲線重疊?？梢钥吹剑瑹o論測試組還是對(duì)照組，均在使用后5 min能使皮膚的彈性程度與水分值達(dá)到一個(gè)高峰，之后空白組的皮膚狀態(tài)會(huì)很快恢復(fù)到使用前的水平，而配方1和配方2及市售精華乳雖在施加5 min后對(duì)皮膚的改善效果會(huì)略有下降，但在測試的2 h內(nèi)，皮膚的彈性程度基本能提升1個(gè)檔次且能維持平穩(wěn)。而通過皮膚水分測試，發(fā)現(xiàn)1 h內(nèi)兩種配方及市售精華乳均能使其增加20%以上，且2 h內(nèi)能在皮膚表面鎖住一定量的水分，有一定的保濕效果。其中配方2對(duì)于皮膚水分的提升效果甚至優(yōu)于市售精華乳。

圖4 不同配方微乳精華使用前后的皮膚彈性和水分值變化Fig.4 Changes in skin elasticity and moisture values before and after using microemulsions of different formulas

鼠李糖脂是從微生物利用植物油脂為主要原料發(fā)酵得到，其制備過程從原料到生產(chǎn)過程都十分吻合綠色化工的各項(xiàng)要求，且產(chǎn)品表面性能優(yōu)秀[4-5]，可部分替代石油基化學(xué)表面活性劑。另外，鼠李糖脂的健康特性、可降解性以及多種護(hù)膚活性[8-9]使其具有較強(qiáng)競爭力的化妝品原料。本工作對(duì)鼠李糖脂制備微乳液的研究結(jié)果表明，所得到的微乳液具有理想的物理化學(xué)性質(zhì)、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和護(hù)膚活性，所得到的鼠李糖脂微乳液制備工藝將推動(dòng)其在化妝品工業(yè)的實(shí)際應(yīng)用。

3 結(jié) 論

使用生物表面活性劑鼠李糖脂配制微乳，構(gòu)建鼠李糖脂-角鯊?fù)?甘油-水微乳體系，可得到粒徑在44 nm左右穩(wěn)定性良好的微乳液。在鼠李糖脂-角鯊?fù)?甘油-水微乳體系基礎(chǔ)上配制微乳精華護(hù)膚品，通過理化性質(zhì)測定、穩(wěn)定性分析、主觀評(píng)估和功效評(píng)價(jià)，可得到最佳配比為：鼠李糖脂14.4%，甘油28.9%，角鯊?fù)?.7%，鼠李糖1.4%，木糖醇1.4%，苯氧乙醇1.0%，蒸餾水44.2%。使用該配方得到的微乳精華外觀澄清透明，流動(dòng)性良好，pH值在6.0左右，穩(wěn)定性較強(qiáng)，能改善皮膚的彈性并提升水分值，且在2 h內(nèi)該作用能得到保持?？傊?，鼠李糖脂適合制備面向化妝品工業(yè)應(yīng)用的微乳液。