劉曉靜，秦毓敏，鐘友剛，田樹軍*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000；2.北京希諾谷生物科技有限公司，北京 102200；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100089）

關(guān)鍵字：C 型鈉鈦；犬卵母細(xì)胞；成熟率

犬卵巢上成熟卵泡排出的卵母細(xì)胞仍需要在輸卵管內(nèi)成熟2～3 d 才排出第一極體，這是犬卵母細(xì)胞區(qū)別于牛、羊、豬等其他物種的特點(diǎn)[1]。在犬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)研究中，前人嘗試在培養(yǎng)液中添加促性腺激素[2]、生長(zhǎng)因子[3]、各種血清[4]等物質(zhì)，采用與犬輸卵管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)[5]、將卵母細(xì)胞注入體外培養(yǎng)的輸卵管內(nèi)[6]等方法，但成熟率仍不超過20%。兩步成熟法是先將卵母細(xì)胞放入減數(shù)分裂抑制劑中處理一段時(shí)間，再進(jìn)行常規(guī)體外成熟培養(yǎng)[7]。亞胺環(huán)己酮、次黃嘌呤、環(huán)磷酸腺苷（Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP）類似物等均可在兩步成熟法中作為減數(shù)分裂抑制劑，但屬于非特異性抑制劑會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量造成負(fù)面影響，從而降低卵母細(xì)胞的后續(xù)發(fā)育能力[8-9]。

C 型鈉鈦（C-type Natriuretic Peptide，CNP）是天然存在于小鼠卵泡中的一種生理性多肽，能夠阻滯卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的發(fā)生[10]。研究證實(shí)，CNP 能提高牛卵母細(xì)胞體外成熟率和囊胚發(fā)育率[11]，同時(shí)在貓上也得到證實(shí)[12]。犬卵母細(xì)胞中CNP 及其受體的分布與其他物種一致[13]，都是由壁層顆粒細(xì)胞分泌，通過與卵丘顆粒細(xì)胞上的受體結(jié)合來發(fā)揮作用。本研究采用兩步培養(yǎng)法對(duì)犬卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，對(duì)犬卵母細(xì)胞體外成熟體系中添加CNP 的適宜濃度和適宜處理時(shí)間進(jìn)行篩選，以揭示CNP 對(duì)犬卵母細(xì)胞體外成熟效果的影響，并優(yōu)化犬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系。

1 材料與方法

1.1 試劑 M 199 培養(yǎng)基、胎牛血清和雙抗為Gibco 產(chǎn)品；垂體促卵泡素和垂體促黃體素為寧波第二激素廠產(chǎn)品；其余試劑除特殊說明外均為Sigma 產(chǎn)品。

1.2 卵母細(xì)胞采集 在動(dòng)物醫(yī)院收集健康絕育犬的卵巢，置于37℃含有雙抗的生理鹽水中，在2～4 h 內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，去掉多余組織，用生理鹽水清洗3 次，放入割卵液（M 199+10%FBS）中用縱橫切割法盡可能的釋放卵丘卵母細(xì)胞，挑選卵丘細(xì)胞大于3 層、直徑大于110 μm 且胞質(zhì)暗黑均勻的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus-Oocyte Complexes，COCs）進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。

1.3 體外成熟培養(yǎng)方法及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 CNP 影響犬卵母細(xì)胞核成熟進(jìn)程的有效性驗(yàn)證將合格的COCs 隨機(jī)分為2 組，分別放入事先平衡至少2 h 的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的成熟液微滴（100 μL）中，進(jìn)行成熟培養(yǎng)，每個(gè)微滴培養(yǎng)15～20 枚COCs，培養(yǎng)條件為38.5℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2和飽和濕度。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別在6、12、18、24 h 取出適量的COCs，進(jìn)行核相觀察。

對(duì)照組培養(yǎng)液成分為含10%FBS 的M 199、1 nmol/L半胱氨酸、0.2 nmol/L 丙酮酸鈉、1% 雙抗。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液成分為含10%FBS 的M 199、1 nmol/L 半胱氨酸、0.2 nmol/L 丙酮酸鈉、1%雙抗、50 nmol/L CNP。

1.3.2 篩選適宜的CNP 處理濃度 將合格的COCs 隨機(jī)分組，分別置入事先平衡至少2 h 的CNP 實(shí)驗(yàn)組（CNP濃度分別為50、100、500、1 000 nmol/L）的成熟液微滴（100 μL）中，進(jìn)行6 h 的第1 步成熟培養(yǎng)；然后將其轉(zhuǎn)入常規(guī)成熟液中進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)為72 h 的第2 步成熟培養(yǎng)，期間每24 h 進(jìn)行全換液。對(duì)照組在對(duì)照組培養(yǎng)液中成熟培養(yǎng)6 h，再在常規(guī)成熟液中成熟培養(yǎng)72 h，每24 h 進(jìn)行全換液。于成熟培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，對(duì)COCs 進(jìn)行核相觀察。

常規(guī)成熟液成分為含10 %FBS 的M 199、1 nmol/L 半胱氨酸、0.2 nmol/L 丙酮酸鈉、0.8 IU 促卵泡素、2 IU促黃體素、1 %雙抗。對(duì)照組處理液成分為含10 %FBS的M 199、1 nmol/L 半 胱 氨 酸、0.2 nmol/L 丙 酮 酸鈉、1 % 雙抗。實(shí)驗(yàn)組處理液成分為含10 %FBS 的M 199、1 nmol/L 半胱氨酸、0.2 nmol/L 丙酮酸鈉、1 %雙抗、CNP（50、100、500、1 000 nmol/L）。

1.3.3 CNP 處理的適宜時(shí)長(zhǎng)研究 將合格的COCs 隨機(jī)分組，放入CNP 濃度為100 nmol/L（經(jīng)1.3.2 篩選得出）且事先平衡至少2 h 的成熟液微滴（100 μL）中，分別進(jìn)行6、12、18、24 h 的第1 步成熟培養(yǎng)；然而將其轉(zhuǎn)入常規(guī)成熟液中進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)為72 h 的第2 步成熟培養(yǎng)，期間每24 h 進(jìn)行全換液。于成熟培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，對(duì)COCs進(jìn)行核相觀察。

1.4 卵母細(xì)胞染色判定核相

1.4.1 脫卵丘 將成熟的卵丘卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入1% 透明質(zhì)酸酶中處理1 min，期間用槍口光滑的移液槍不斷輕輕吹打，然后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至成熟培養(yǎng)滴中，更換與卵母細(xì)胞直徑相差不大的胚胎吸針，反復(fù)吹吸刮去卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，等卵丘完全去除后，用割卵液充分潤(rùn)洗3 遍，防止卵丘細(xì)胞影響核相的判讀。

1.4.2 染色 用胚胎吸針將裸卵轉(zhuǎn)移到10 mg/mL 的Hochest 33342 中進(jìn)行5 min 避光染色。

1.4.3 核相判定 將染色后的裸卵在DPBS 中清洗3 遍，放入預(yù)先做好的成熟培養(yǎng)液微滴中，在倒置顯微鏡下，激發(fā)熒光，觀察細(xì)胞核染色情況，拍照并對(duì)核相進(jìn)行判定，記錄不同時(shí)期卵母細(xì)胞的數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0 進(jìn)行單因素ANOVA 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 CNP 影響犬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程有效性驗(yàn)證 體外成熟培養(yǎng)6、12、18、24 h 的犬卵母細(xì)胞 825 枚，分別脫卵丘染色并在熒光顯微鏡下觀察核相。根據(jù)細(xì)胞核形態(tài)分為生發(fā)泡期（Germinal Vesicle，GV）、生發(fā)泡破裂期（Germinal Vesicle Breakdown，GVBD）、第1 次減數(shù)分裂中期（Metaphase I，MI）、第2 次減數(shù)分裂中期（Metaphase II，MII）、退化期（Degeneration，DE）。各時(shí)期犬卵母細(xì)胞的核相特征如圖1 所示，GV 期卵母細(xì)胞的核膜清晰可見；GVBD 期卵母細(xì)胞的核膜消失染色質(zhì)擴(kuò)散；MI 期染色質(zhì)凝集在赤道面上；MII 期第一極體位于染色質(zhì)附近或第一極體排除至卵周隙；DE 期則未見核物質(zhì)，退化。從表1 可以看出，CNP 處理12 h組的存活率顯著高于對(duì)照組，GVBD-MI 期卵母細(xì)胞的比率顯著低于對(duì)照組，表明用CNP 處理12 h 后能提高卵母細(xì)胞的存活率，并且能夠在一定程度上阻滯犬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂；CNP 處理18 h 組處于GV 期的卵母細(xì)胞顯著高于對(duì)照組，表明用CNP 處理卵母細(xì)胞18 h 后仍有阻滯卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的作用。

2.2 不同濃度 CNP 處理對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟效果的影響由表2 可知，500 nmol/L 組和1 000 nmol/L 組的存活率、GV、GVBD、MI 和MII 時(shí)期卵母細(xì)胞比例均極顯著低于對(duì)照組，DE 的卵母細(xì)胞比例極顯著高于對(duì)照組，表明高濃度的CNP 預(yù)處理不利于犬的體外成熟（In Vitro Maturation,IVM），并且能增加卵母細(xì)胞的退化率。50 nmol/L 組和100 nmol/L 組的存活率、GV、GVBD時(shí)期卵母細(xì)胞所占比率差異不顯著，但50 nmol/L 組MII 期卵母細(xì)胞所占比例顯著低于對(duì)照組和100 nmol/L組。說明100 nmol/L CNP 預(yù)處理犬卵母細(xì)胞有可能會(huì)提高犬卵母細(xì)胞的成熟率。

2.3 CNP 處理不同時(shí)間犬卵母細(xì)胞對(duì)成熟率的影響如表3 所示，CNP 處理12 h 組的存活率、MII 以及DE時(shí)期卵母細(xì)胞所占比例均極顯著高于對(duì)照組，說明用CNP 處理犬卵母細(xì)胞進(jìn)行成熟培養(yǎng)是有利的；24 h 組存活率、GV 以及MII 時(shí)期比率均極顯著低于對(duì)照組，說明用CNP 預(yù)處理長(zhǎng)時(shí)間后不利于犬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)；12 h 組存活率、MII 和DE 時(shí)期比率均極顯著高于6 h 組、18 h 組和24 h 組，說明用CNP 預(yù)處理犬卵母細(xì)胞12 h 最利于犬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)，可提其高體外成熟培養(yǎng)效果。

3 討 論

在卵母細(xì)胞體外成熟過程中，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)同時(shí)成熟才能保證卵母細(xì)胞在體外受精后胚胎的發(fā)育能力。CNP 通過壁層顆粒細(xì)胞細(xì)胞分泌和卵丘細(xì)胞上鈉鈦受體NPR2（Natriuretic Peptide Receptor 2，NPR2）結(jié)合，通過激活鳥苷酸環(huán)化酶將環(huán)三磷酸鳥苷（Cyclic Guanosine Triphosphate，cGTP）轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸鳥苷（Cyclic Guanosine Monophosphate，cGMP），cGMP 通過細(xì)胞間隙進(jìn)入卵母細(xì)胞內(nèi)抑制磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）的活性，能夠維持卵母細(xì)胞內(nèi)高水平的cAMP，從而維持減數(shù)分裂阻滯。目前已有研究證實(shí)CNP 能夠阻滯貓卵母細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂[12]，CNP 處理卵母細(xì)胞可獲得更高的成熟率并且卵母細(xì)胞體外受精率和囊胚率顯著升高[11]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了CNP 在犬卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)上也能有效延后減數(shù)分裂的發(fā)生，12 h 組的GVBD-MI 卵母細(xì)胞占比顯著高于對(duì)照組，存活率也顯著高于對(duì)照組，表明CNP 在一定時(shí)間內(nèi)能夠阻滯犬卵母細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂作用，并隨著CNP 處理的時(shí)間增加，阻滯卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的作用變得越來越弱，這與CNP 受體的數(shù)量下降有關(guān)[13]。

表1 CNP 影響犬卵母細(xì)胞核相進(jìn)程有效性驗(yàn)證結(jié)果

表2 不同濃度 CNP 處理對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟效果的影響

表3 CNP 處理不同時(shí)間犬卵母細(xì)胞對(duì)成熟率的影響

有研究證實(shí)，在犬卵巢上剛排出卵母細(xì)胞時(shí)輸卵管液中孕酮含量很低，當(dāng)卵母細(xì)胞成熟時(shí)才達(dá)到很高的濃度[14]。前人的一些實(shí)驗(yàn)直接添加促性腺激素培養(yǎng)，結(jié)果成熟率普遍很低，退化率也偏高[15]，推測(cè)與卵母細(xì)胞直接在含有一定濃度促性腺激素激素中進(jìn)行成熟培養(yǎng)有關(guān)，這可能會(huì)加快卵母細(xì)胞的退化和死亡。本研究結(jié)果顯示用CNP 處理犬卵母細(xì)胞適當(dāng)?shù)臅r(shí)間能夠提高卵母細(xì)胞的存活率，是否與預(yù)處理階段的成熟液中未加入促性腺激素有關(guān)則有待進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究根據(jù)犬特殊的生理特性，采用含有CNP 且不含促性腺激素的成熟液預(yù)處理犬卵母細(xì)胞進(jìn)行第一步成熟培養(yǎng)，既可以阻滯細(xì)胞核成熟，又可降低卵母細(xì)胞發(fā)生退化和死亡的概率，然后再轉(zhuǎn)入常規(guī)培養(yǎng)液進(jìn)行第2 步成熟培養(yǎng)，使犬卵母細(xì)胞成熟率得到提高，與CNP 在豬、牛[11]、羊以及貓[12]上的研究結(jié)論類似。這很可能是因?yàn)镃NP 延緩了縫隙連接蛋白解體加強(qiáng)了卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞間通訊，推遲了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的重新啟動(dòng)，促進(jìn)了卵母細(xì)胞核質(zhì)發(fā)育的同步性，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。本研究為進(jìn)一步探討CNP 促進(jìn)卵母細(xì)胞核質(zhì)發(fā)育同步從而提高卵母細(xì)胞發(fā)育能力奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)條件下，犬卵母細(xì)胞在含有100 nmol/LCNP 的培養(yǎng)液中體外成熟12 h（第1 步成熟培養(yǎng)），然后轉(zhuǎn)入常規(guī)培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)72 h（第2 步成熟培養(yǎng)），可提高犬卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)效果。