李 倩，李蘭蘭，欒兆進(jìn)，王國(guó)義，柳 楠，賀建寧*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.包頭市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古包頭 014013；3.赤峰市敖漢種羊場(chǎng)，內(nèi)蒙古赤峰 024300）

骨骼肌發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，主要包括骨骼肌細(xì)胞增殖、分化、肌管融合、肌纖維肥大等，這一系列過(guò)程會(huì)受到一些調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，除廣泛所知的生肌調(diào)節(jié)因子家族（MRFs）和肌細(xì)胞增強(qiáng)因子家族（MEF2）起調(diào)控作用外，已經(jīng)有越來(lái)越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)是另一種重要的調(diào)節(jié)因子。因此，研究調(diào)控綿羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制，進(jìn)而為肉羊分子育種提供一定的理論依據(jù)。

miRNA 的表達(dá)有著組織特異性，并且它們中的大多數(shù)僅在特定組織和發(fā)育階段表達(dá)并起作用[1]。一組稱(chēng)為MyomiRs 的miRNAs 在心肌或骨骼肌中高度表達(dá)，主要包括miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-206、miR-208、miR-208b、miR-486 及miR-499[2-4]。近年來(lái)，在生物科學(xué)方面關(guān)于miRNAs 對(duì)動(dòng)物生理調(diào)控的研究十分火熱。同樣也有大量的研究表明miRNAs 在肌肉發(fā)育方面有著強(qiáng)大的調(diào)控作用。Dicer（miRNAs 成熟所必需的酶）的缺失引起小鼠肌肉發(fā)育異常而死亡[5]。miR-140-3p 同樣對(duì)骨骼肌細(xì)胞具有調(diào)控作用[6]；miR-151-3p 通過(guò)調(diào)控ATP2a2 的表達(dá)量來(lái)影響骨骼肌細(xì)胞的形成[7]。多種miRNAs 通過(guò)與MRFs 的相互作用在成肌細(xì)胞的增殖和分化中起到至關(guān)重要的作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-374b 特異性結(jié)合Myf6的3' 非翻譯區(qū)（UTR），miR-374b 可直接靶向Myf6并負(fù)調(diào)節(jié)肌細(xì)胞生成，在mRNA 和蛋白水平下調(diào)Myf6基因的表達(dá)[9]。

迄今對(duì)miR-374b 的研究多集中在對(duì)癌細(xì)胞和小鼠成肌細(xì)胞增殖分化的影響，但是否對(duì)綿羊等家畜骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育有影響鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)綿羊不同發(fā)育生長(zhǎng)階段miR-374b 和Myf6基因的表達(dá)規(guī)律及其與單根肌纖維橫截面積變化規(guī)律的關(guān)系，探究出miR-374b 是否會(huì)通過(guò)其靶標(biāo)基因Myf6影響綿羊的骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而為肉羊分子育種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 實(shí)驗(yàn)羊均來(lái)自?xún)?nèi)蒙古赤峰敖漢種羊場(chǎng)，選取同一飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，健康的胎齡90 d、胎齡120 d、初生期、出生后60 d 南非肉用美利奴羊各4 只，采取背最長(zhǎng)肌、股二頭肌組織樣品置于無(wú)RNA 酶的凍存管中，迅速投入液氮，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃冰箱凍存，用于總RNA 的提取；一部分背最長(zhǎng)肌、股二頭肌保存于4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE 染色試驗(yàn)。

1.2 主要試劑 iTaqUniwersal SYBR Green Supermix5 mL購(gòu)自秀佰瑞生物技術(shù)有限公司；95%乙醇、無(wú)水乙醇、二甲苯均購(gòu)自天津化學(xué)試劑有限公司；石蠟購(gòu)自上海華靈康復(fù)器械廠(chǎng)；伊紅購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)集團(tuán)試劑有限公司；蘇木素購(gòu)自上海新中化學(xué)廠(chǎng)。

1.3 組織總RNA 提取及cDNA 合成 采用Trizol 法進(jìn)行總RNA 的提取，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，蛋白核酸分析儀進(jìn)行cDNA 濃度及其OD 值檢測(cè)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量 熒光定量檢測(cè)在伯樂(lè)熒光定量PCR儀CFXConnect中進(jìn)行，Myf6與GAPDH反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40 個(gè)循環(huán)；mir-374b 和5sRNA 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；PCR 反應(yīng)95℃12 s，62℃ 40 s，共40 個(gè)循環(huán)，62℃時(shí)采集熒光信息。

1.5 HE 染色 ①將已經(jīng)切好的切片放至染色架上；②染色：二甲苯(Ⅰ)，8 min →二甲苯(Ⅱ)，8 min →無(wú)水乙醇(Ⅰ)，5 min →無(wú)水乙醇(Ⅱ)，5 min →95%酒精(Ⅰ)，3 min →95% 酒精(Ⅱ)，3 min →80% 酒精，2 min →70% 酒精，2 min →50% 酒精，2 min →蒸餾水，2 min →蘇木精，8 min →自來(lái)水，2 min →蒸餾水，2 min →1%酒精鹽酸，3～5 s →自來(lái)水藍(lán)化，15 min →蒸餾水，2 min →50%酒精，2 min →70%酒精，2 min →80% 酒精，2 min →伊 紅，2 min →95% 酒精(Ⅰ)，3 min →95%酒精(Ⅱ)，5 min →無(wú)水乙醇(Ⅰ)，5 min →無(wú)水乙醇(Ⅱ)，5 min →二甲苯(Ⅰ)，5 min →二甲苯(Ⅱ)，5 min；③封片：于載玻片的標(biāo)本上滴加中性樹(shù)膠并用蓋玻片覆蓋，于陰涼通風(fēng)處晾干。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPASS 20.0 軟件對(duì)miR-374b 和Myf6基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt計(jì)算進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用SPASS 17.0 軟件將4 個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期Myf6、mir-374b 基因的mRNA表達(dá)量和單根肌纖維橫截面積變化進(jìn)行相關(guān)性Person檢驗(yàn)。P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR 擴(kuò)增 如圖1 所示，miR-374b、Myf6和內(nèi)參基因5sRNA、GAPDH的熔解曲線(xiàn)峰值圖只有一個(gè)特異性高峰，無(wú)其他雜峰，表明引物具有較高特異性，可用來(lái)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 miR-374b、Myf6基因在不同時(shí)期背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)規(guī)律 由表1 可知，背最長(zhǎng)肌中miR-374b 和Myf6基因的mRNA 表達(dá)量都在胎齡90 d 時(shí)最高，且極顯著高于其他3 個(gè)時(shí)期。miR-374b 在出生后60 d 表達(dá)量最低，miR-374b 在這4 個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期mRNA 相對(duì)表達(dá)量總體呈下降趨勢(shì)；Myf6在初生期表達(dá)量最低，由初生至出生后60 d 呈上升趨勢(shì)。

由表2 可知，miR-374b 的表達(dá)量在股二頭肌中胎齡120 d 時(shí)最高且極顯著高于其他3 個(gè)時(shí)期，出生后60 d 表達(dá)量最低；Myf6胎齡90 d 表達(dá)量最高且極顯著高于其他3 個(gè)時(shí)期，初生期表達(dá)量低。miR-374b 和Myf6基因在4 個(gè)時(shí)期股二頭肌中的表達(dá)量呈相反趨勢(shì)。

2.4 不同生長(zhǎng)時(shí)期肌肉組織切片結(jié)果 背最長(zhǎng)肌與肱二頭肌在不同生長(zhǎng)時(shí)期的肌肉組織切片結(jié)果如圖2 所示。

2.5 不同時(shí)期單根肌纖維橫截面積 由圖3 可知，背最長(zhǎng)肌和股二頭肌單根肌纖維橫截面積隨著月齡的增加均呈極顯著增長(zhǎng)；股二頭肌單根肌纖維橫截面積總大于背最長(zhǎng)肌。

2.6 miR-374b、Myf6表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積的相關(guān)性分析 由表3 可知，在背最長(zhǎng)肌中miR-374b 表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積變化呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.941，P＜0.01），Myf6表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積變化呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.625，P＜0.05）；在股二頭肌中miR-374b 表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積變化呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.677，P＜0.05）；Myf6表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積變化無(wú)顯著性相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

表1 miR-374b、Myf6 在不同時(shí)期背最長(zhǎng)肌中mRNA 相對(duì)表達(dá)量

表2 miR-374b、Myf6 基因在不同時(shí)期股二頭肌中mRNA 相對(duì)表達(dá)量

表3 背最長(zhǎng)肌中miR-374b、Myf6 表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積相關(guān)性分析

在肌肉發(fā)育的全部過(guò)程中，從胚胎期肌祖細(xì)胞的遷移、增殖、分化及肌纖維的形成，到動(dòng)物在出生后肌肉組織成熟及功能越來(lái)越完善，生肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）家族都有參與[10]。Myf6 是僅有的一個(gè)存在于成熟神經(jīng)節(jié)中的MRFs 家族中的成員[11]，亦位于其他生肌bHLH 因子的下游，在肌纖維的形成和肌肉表型的維持中起作用。

miRNAs 是關(guān)于肌纖維以及骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)控因子，已有miR-1、miR-133 和miR-206 等micro RNA 被證實(shí)參與調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖分化。有研究顯示，將含有miR-1、miR-133 和miR-206 質(zhì)粒的混合液注射到大鼠的脛骨前肌損傷的地方，會(huì)使得骨骼肌再生能力增強(qiáng)，受到損后的第3 天和第7 天MyoD1、MyoG和Pax7表達(dá)水平上升[12]，就會(huì)使得肌肉受到損傷后得到一定的修復(fù)。此外，對(duì)骨骼肌的再生有重要作用的還有一些其他的非肌源性microRNA。miR-431 會(huì)通過(guò)靶向Smad4使老化的骨骼肌再生[13]。但也有一些microRNA 會(huì)對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生抑制作用，miR-128 能夠使得Sp1 的表達(dá)受到抑制，從而調(diào)控牛成肌細(xì)胞的增殖[14]；miR-128 可以靶向肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN），使骨骼肌細(xì)胞增殖受到抑制從而促進(jìn)其分化[15]。還有研究證明在小鼠中miR-374b 可直接靶定Myf6基因以調(diào)控成肌細(xì)胞的分化，而miR-374b在綿羊出生前及出生后的不同骨骼肌發(fā)育時(shí)期與Myf6基因的表達(dá)關(guān)系還未有研究。本研究結(jié)果表明，miR-374b 與Myf6基因在南非肉用美利奴羊的4 個(gè)不同發(fā)育生長(zhǎng)階段的背最長(zhǎng)肌中mRNA 表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，都呈下降趨勢(shì)，但是在出生后60 d 時(shí)miR-374b 基因mRNA 表達(dá)量持續(xù)下降，Myf6基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì)；在股二頭肌中miR-374b mRNA 表達(dá)量先上升后下降，Myf6基因mRNA 表達(dá)量先下降后上升，2 個(gè)基因mRNA 表達(dá)變化趨勢(shì)相反，Myf6western blot 蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Myf6基因Q-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。隨著綿羊日齡的增加、體重體長(zhǎng)增加、肌纖維增粗，miR-374b 的表達(dá)量總體呈下降趨勢(shì)。該結(jié)果說(shuō)明miR-374b對(duì)Myf6基因的負(fù)調(diào)控作用在這4 個(gè)時(shí)期主要表現(xiàn)在股二頭肌中，推測(cè)miR-374b 在綿羊不同部位生長(zhǎng)發(fā)育的前后期所發(fā)揮的生物學(xué)功能不同，miR-374b 對(duì)綿羊骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的負(fù)調(diào)控作用。

骨骼肌是動(dòng)物體的核心成分，一些產(chǎn)肉量高的動(dòng)物骨骼肌約占動(dòng)物體的一半。骨骼肌主要是由肌纖維組成，各肌纖維類(lèi)型所占的比例決定了動(dòng)物的肉產(chǎn)量和肉質(zhì)風(fēng)味[16-17]。一般來(lái)說(shuō)，肌肉纖維數(shù)量能夠在哺乳動(dòng)物胎兒發(fā)育階段達(dá)到最大值，出生之后肌纖維的數(shù)量通常不會(huì)改變，肌肉的生長(zhǎng)主要取決于肌纖維直徑的增長(zhǎng)和肌纖維類(lèi)型的相互轉(zhuǎn)化[18]。骨骼肌的生長(zhǎng)和肥大與許多因素有關(guān)，包括動(dòng)物飲食和外部環(huán)境。骨骼肌的發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的生物過(guò)程，受許多遺傳因素的調(diào)節(jié)，如肌源性調(diào)節(jié)因子、原代細(xì)胞生成素和肌肉生長(zhǎng)抑制素[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，南非肉用美利奴羊的4 個(gè)不同發(fā)育生長(zhǎng)階段的背最長(zhǎng)肌和股二頭肌單根肌纖維橫截面積隨著月齡的增長(zhǎng)而增大，肌纖維橫截面積均表現(xiàn)為股二頭?。颈匙铋L(zhǎng)?。辉诒匙铋L(zhǎng)肌及股二頭肌中miR-374b 表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積變化分別呈極顯著和顯著負(fù)相關(guān)；而Myf6表達(dá)量在背最長(zhǎng)肌中與單根肌纖維橫截面積變化顯著性負(fù)相關(guān)，在股二頭肌中與單根肌纖維橫截面積變化無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。馬志遠(yuǎn)[20]研究也發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-374b 可使快肌纖維和慢肌纖維均受到抑制，由此推測(cè)miR-374b 負(fù)向調(diào)控肌纖維生長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，miR-374b 在4 個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期（胎齡90 d、胎齡120 d、初生期、出生后60 d）主要在股二頭肌對(duì)Myf6基因起負(fù)調(diào)控作用。利用miR-374b、Myf6在綿羊不同時(shí)期的表達(dá)規(guī)律及其與單根肌纖維橫截面積的關(guān)聯(lián)分析，得出miR-374b 可能是負(fù)向調(diào)控肌纖維生長(zhǎng)。