彭學勤 崔園園 褚明亮

1.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽550002；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝453100；3.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，貴州貴陽550000

Chelex-100 是一種由二乙烯苯、苯乙烯共聚體組成的化學螯合樹脂，其懸液在堿性環(huán)境（pH10～11）和100℃的條件下，可導致細胞膜的破裂和DNA 的變性并釋放出來［1-2］，同時Chelex-100 含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，對高價金屬離子有很高的親和力和螯合作用，從而防止DNA 在高溫下降解，并且Chelex-100 還能結(jié)合許多可能影響下一步PCR 分析的其他外源物質(zhì)［1］。由于具有這些優(yōu)點，Chelex-100 提取DNA具有高效、經(jīng)濟、快速等優(yōu)勢，特別是當檢材或含有的目的基因DNA 較少時，可以用Chelex-100 提取方法提取DNA［3-5］。

隨著分子病理學的發(fā)展，越來越多的病理檢測項目需要從石蠟組織中提取基因組DNA，包括結(jié)核分枝桿菌DNA［6］。從石蠟組織中提取結(jié)核分枝桿菌DNA的方法雖然多種多樣，但有的過程繁瑣復雜，有的成本太高，有的提取效率不高［6-8］，Chelex-100 用于提取石蠟組織中的結(jié)核分枝桿菌DNA 還沒有報道。本研究利用Chelex-100 作為基質(zhì)，一步法提取石蠟組織中的結(jié)核分枝桿菌DNA，建立從石蠟組織中高效快速提取結(jié)核分枝桿菌DNA 的方法。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取貴州省人民醫(yī)院2019 年6～7 月臨床確診為結(jié)核病例的石蠟組織58 例（其中抗酸染色陽性標本11 例，抗酸染色陰性標本47 例）。

1.2 試劑與儀器 商業(yè)化的石蠟組織DNA 提取試劑盒（廈門艾德生物公司，F(xiàn)FPE DNA），結(jié)核分枝桿菌核酸擴增PCR 熒光檢測試劑盒（中山大學達安基因公司），Chelex-100（Sigma 公司），十二烷基硫酸鈉（SDS，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司），吐溫-20（Tween-20，碧云天生物技術(shù)公司），乙基苯基聚乙二醇（NP-40，碧云天生物技術(shù)公司），熒光PCR 儀（安捷倫公司，Mx3000P）。

1.3 試劑盒提取結(jié)核分枝桿菌DNA 按照FFPE DNA提取試劑盒說明書，提取石蠟組織中的總的基因組DNA（包括了組織DNA 和結(jié)核分枝桿菌DNA）。

1.4 Chelex-100 為基質(zhì)的試劑配比 15%Chelex-100（w/v），0.1%SDS（w/v），1%Tween-20（v/v），1%NP-40（v/v），去離子水，混勻備用。

1.5 Chelex-100 為基質(zhì)的試劑提取結(jié)核分枝桿菌DNA石蠟切片5μm，切3～4 張，放入1.5mL EP 管中，加入1mL 二甲苯渦旋混勻，12 000g 離心30s，棄去二甲苯，再重復上述過程一次。隨后加入1mL 無水乙醇渦旋混勻，12 000g 離心30s，棄去無水乙醇，再重復上述過程一次。將上述EP 管放入56℃金屬浴中1～2min，再用移液器吸取剩余的殘留液體（融化的殘留石蠟及無水乙醇混合物）。每個管中加入200～300μL 的完全混勻的Chelex-100 為基質(zhì)的試劑，渦旋，100℃金屬浴中15min。冷卻至室溫后，12 000g 離心5min，取上清液（即提取到的DNA 溶液）備用。

1.6 PCR 擴增 取上述2 種方法提取到的DNA 溶液4μL 作PCR 擴增。反應條件：93℃2min 預變性；93℃45s，55℃60s，10 個循環(huán)；然后，93℃30s，55℃45s，35 個循環(huán)。在55℃45s 時收集FAM 通道熒光信號。擴增結(jié)束后進行數(shù)據(jù)分析，得出結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0 處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用配對χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。判斷兩種提取方法的一致性，采用Kappa 檢驗，其中Kappa＞0.75 視為有高度一致性。

2 結(jié)果

在11 例抗酸染色陽性標本中，Chelex-100 為基質(zhì)的試劑提取的DNA 和商業(yè)化試劑盒提取的DNA進行結(jié)核分枝桿菌PCR 驗證，結(jié)果顯示兩種提取方法的陽性率都是100%。在47 例抗酸染色陰性標本中，Chelex-100 為基質(zhì)的試劑提取的DNA 和商業(yè)化試劑盒提取的DNA 進行結(jié)核分枝桿菌PCR 驗證，結(jié)果顯示商業(yè)化試劑盒法的陽性率為40%（19/47），Chelex-100 法的陽性率為38%（18/47）。58 例標本，發(fā)現(xiàn)兩種提取方法均陽性的標本為28 例；兩種提取方法均為陰性的標本為27 例；經(jīng)Kappa 一致性檢驗，Kappa 值為0.897，提示兩種提取方法有非常高的一致性。

表1 抗酸標本中兩種提取方法PCR 結(jié)果比較

3 討論

結(jié)核病是嚴重威脅人類健康的重要傳染性疾病之一，病理學診斷是微生物學之外最重要的結(jié)核病確診途徑［9］?？顾崛旧遣±韺W中診斷結(jié)核病最常用的特殊染色方法，然而抗酸染色診斷陽性率一般較低，抗酸陰性不能否定結(jié)核桿菌的存在［10］。近年來，隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，分子PCR 診斷技術(shù)在結(jié)核病的診斷中起到越來越重要的作用［7-10］。但遺憾的是，由于病理科檢測的量相對檢驗科較少，所以商業(yè)化開發(fā)的結(jié)核PCR 試劑的適應范圍并沒有涵蓋到特殊的石蠟病理標本，病理科都是在摸索中優(yōu)化不同的實驗條件，特別是前期的提取石蠟組織標本DNA 的步驟，適用于后續(xù)的分子病理PCR 檢測［6，11-12］，但是以上實驗中DNA 提取的方法不同程度的存在時間較長或試劑價格昂貴等問題。Lamballerie 等［2］研究了Chelex-100試劑提取不同種類細菌DNA 的最適濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10%～15%的Chelex-100（w/v）和0.1%SDS（w/v），1%Tween-20（v/v），1%NP-40（v/v）組成的混合試劑對結(jié)核桿菌DNA 有快速提取效果。但是迄今為止，還沒有關(guān)于是否可以應用Chelex-100 快速提取石蠟標本中結(jié)核DNA 的報道，因此本實驗對此進行了研究。應用Chelex-100 為基質(zhì)的混合試劑提取到的DNA 的PCR 結(jié)果和商業(yè)化試劑盒的結(jié)果無顯著性差異。并且與商品化的提取試劑盒相比，Chelex-100 法提取過程均在一個EP 管內(nèi)進行，可以減少操作上可能的失誤，避免污染。由于臨床活檢小標本越來越多，Chelex-100 法的另一個優(yōu)勢是需要的檢材標本用量可以很少。另外，相對于商品化提取試劑盒來說，Chelex-100 提取成本更經(jīng)濟。

綜上所述，Chelex-100 提取石蠟組織中結(jié)核桿菌基因組DNA 是一種快速、經(jīng)濟、有效的方法。值得臨床推廣。