張樂超 劉月琴 段春輝 張英杰 王泳 郭云霞

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定 071000；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科技學(xué)院，保定 071000）

山羊是人類馴化較早的動物，為人們提供肉、絨、毛、皮、奶等多種畜產(chǎn)品，在畜牧生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。我國山羊品種資源豐富，有著悠久的馴化和養(yǎng)殖歷史，就河北省及周邊地區(qū)就存在多個優(yōu)良地方山羊品種，如武安山羊、承德無角山羊、太行山羊、燕山絨山羊、遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊和濟寧青山羊等。這些地方品種，無論是在促進當?shù)亟?jīng)濟發(fā)展還是在促進我國出口創(chuàng)匯中，均占有重要地位。隨著國外羊品種的大量引進及肉用綿羊的大量養(yǎng)殖，這些優(yōu)秀的地方山羊品種的養(yǎng)殖規(guī)模和存欄數(shù)量不斷減少，作為生物多樣性的重要組成部分，亟需加強保護和利用。

有許多研究表明，分子標記可用于基因多樣性分析。到目前為止，有各種分子標記研究遺傳多樣性，例如限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphi，RFLP）、 隨 機 擴 增 多態(tài) 性 DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態(tài)性（Rmplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）和單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP） 等［1-5］。SSR 又 稱為微衛(wèi)星標記，由于其共顯性遺傳、高程度的等位基因多樣化、相對多態(tài)性豐富和廣泛的基因組分布，可以有效地促進遺傳關(guān)系的建立，是分析生物遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的常用方法［6］。

為充分保護和利用地方山羊遺傳資源的多樣性，本研究選取15對微衛(wèi)星位點分析河北省及周邊地區(qū)7個地方山羊群體的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，旨在為地方山羊品種的種質(zhì)資源保護和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集30只燕山絨山羊（青龍利紅絨山羊技術(shù)服務(wù)中心）、23只濟寧青山羊（灤平虎什哈養(yǎng)殖場）、30只承德無角山羊（寬城立東養(yǎng)殖有限公司）、30只太行山羊（阜平縣銀洞山肉羊養(yǎng)殖專業(yè)合作社）、36只武安山羊（武安市馬家莊太行飼養(yǎng)場）、31只遼寧絨山羊（遼寧絨山羊科技示范場）的血液樣品，以及33只內(nèi)蒙古絨山羊（阿拉善型）（內(nèi)蒙古億維白絨山羊有限責(zé)任公司）的耳組織，213份樣品均為隨機取樣，且均為沒有親緣關(guān)系的母羊。利用血液基因組DNA提取試劑盒（DP348）天根生化科技有限公司（北京）提取基因組DNA（圖1）。

圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

1.2 方法

1.2.1 微衛(wèi)星位點的引物設(shè)計 參照聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）及國際遺傳學(xué)會（ISAG）的推薦并查閱相關(guān)文獻，選用15對熒光標記微衛(wèi)星引物（表1），引物由通用生物系統(tǒng)有限公司合成（安徽）。

1.2.2 PCR擴增 PCR擴增的反應(yīng)體系為：ddH2O 14.8 μL，dNTP 0.4 μL，Buffer 2 μL，F(xiàn) 0.3 μL（20μmol/L），R 0.3 μL（20 μmol/L），DNA 模 板 2 μL，Taq 0.2 μL，共 20 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火35 s，72℃延伸40 s，共35個循環(huán)；最終72℃延伸3 min（圖2）。

1.2.3 毛細管電泳 將甲酰胺與分子量內(nèi)標按100∶1的體積比混勻后，取15 μL加入上樣板中，再加入1 μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物，然后使用3730XL測序儀進行毛細管電泳（圖3）。

1.2.4 遺傳變異分析 利用Genemarker中的Fragment（Plant）片段分析軟件對測序儀得到的原始數(shù)據(jù)進行分析，將各泳道內(nèi)分子量內(nèi)標的位置與各樣品峰值的位置做比較分析，得到片段大小。把15個微衛(wèi)星位點的等位基因片段大小進行編號，由大到小依次為1-21。利用Popgene32計算等位基因頻率、有效等位基因數(shù)（Effective numbers of alleles，Ne）、期望雜 合 度（Expected heterozygosity，He）、觀測雜合度（Observed heterozygosity，Ho）、F統(tǒng)計量（Fit和Fst）、基因流（Gene flow，Nm）、Shannon指數(shù)（I）等指標。利用PIC-Calc軟件計算多態(tài)信息含量（Polymorphism information content，PIC）。利用Dispan軟件統(tǒng)計各群體Nei’s遺傳距離，并聚類分析。利用MEGA4.0軟件構(gòu)建群體UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 15個微衛(wèi)星位點的引物序列

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 毛細管電泳檢測部分結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 7個地方山羊品種群體內(nèi)遺傳變異分析

7個地方山羊品種15個微衛(wèi)星位點的等位基因頻率分析結(jié)果見表2。由表2可知，15個位點共檢測到了172個等位基因。其中，BM6526位點的等位基因最多，為21個，片段大小為152-191 bp；INRA063位點的等位基因最少，為6個，片段大小為169-179 bp。在所檢測到的等位基因中ILSTS005位點181 bp片段基因頻率最高為0.689 6，其次為BM1225位點221 bp片段，基因頻率為0.669；而OarFCB48標記的163 bp片段、OarFCB20標記的112 bp片段、CSRD247標記的248 bp片段、ILSTS087標記的164 bp片段、TGLA53標記的158 bp片段、BM1225標記的252 bp片段和BMS574標記的122 bp片段的基因頻率最低，均為0.002 3。

7個地方山羊品種15個微衛(wèi)星位點的多態(tài)性分析結(jié)果見表3。由表3可知，所有微衛(wèi)星位點的有效等位基因數(shù)（Ne）范圍為1.928 1（ILSTS005）-10.257（BM6526）， 觀 察 雜 合 度（Ho） 范 圍 為 0.436 6（BM1225）- 0.887 3（BMS574），期望雜合度（He）范圍為 0.482 5（ILST005）-0.904 7（BM6526），平均多態(tài)信息含量（PIC）范圍為0.439 9（ILSTS005）-0.894 9（BM6526），均屬于高度多態(tài)。

7個地方山羊品種15個微衛(wèi)星位點的遺傳變異分析結(jié)果見表4。由表4可知，7個地方山羊群體15個微衛(wèi)星位點Shannon指數(shù)（I）均大于1，有效等位基因數(shù)在3-5之間，等位基因數(shù)較多，有較高的觀察雜合度和較高的期望雜合度，平均多態(tài)信息含量范圍為0.637 1-0.748 5，為高度多態(tài)。

2.2 微衛(wèi)星位點的遺傳分化

各微衛(wèi)星位點F-統(tǒng)計量分析見表5。由表5可知，7個山羊群體的平均群體間基因分化系數(shù)（Fst）為0.544 2，平均基因流（Nm）為0.209 4，總?cè)后w近交系數(shù)（Fit）為0.088 3。

表2 7個地方品種山羊15個微衛(wèi)星位點的等位基因頻率

2.3 7個地方山羊品種遺傳距離及聚類分析

由表6可知，7個地方山羊品種的相似系數(shù)范圍為0.764 8-0.927 4，遺傳距離范圍為0.075 4-0268 2。武安山羊和承德無角山羊相似系數(shù)最大（0.927 4），遺傳距離最近（0.075 4）；太行山羊和燕山絨山羊相似系數(shù)最?。?.764 8），遺傳距離最遠（0.268 2）。同時，依據(jù)遺傳相似系數(shù)對7個地方山羊群體進行聚類分析，結(jié)果見圖4，7個山羊群體被聚為2類，濟寧青山羊、承德無角山羊、武安山羊、內(nèi)蒙古絨山羊和太行山羊聚為一類，燕山絨山羊和遼寧絨山羊聚為一類。

表3 7個地方山羊品種15個微衛(wèi)星位點多態(tài)信息指標

表4 7個山羊群體在15個微衛(wèi)星位點遺傳變異結(jié)果

表5 15個微衛(wèi)星位點F-統(tǒng)計量分析表

表6 7個地方山羊群體間的Nei’s遺傳距離和相似系數(shù)

3 討論

3.1 7個地方山羊品種群體內(nèi)遺傳變異分析

等位基因頻率是衡量動物群體遺傳結(jié)構(gòu)、估計遺傳變異的重要指標［7］，群體中頻率最高、片段最大的等位基因是該物種最保守的基因，而其余等位基因則是在進化過程中由該基因突變產(chǎn)生的［8］。王可等［9］利用12個微衛(wèi)星標記研究濟寧青山羊群體遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)SRCRSP8位點的230 bp和232 bp片段的基因頻率為0.281 3和0.322 9，遠大于236 bp和240 bp的基因頻率0.010 4，認為前兩個片段可能為原始基因，后兩個片段可能是突變基因。本試驗也發(fā)現(xiàn)了基因頻率相差較大的片段，如ILSTS005位點181 bp片段基因頻率為0.689 6，173 bp片段基因頻率為0.002 4，推測181 bp片段可能為原始基因，173 bp片段可能為突變基因。有效等位基因數(shù)可反映群體遺傳變異，其數(shù)值越接近等位基因數(shù)，等位基因在群體中分布越均勻［10］。本試驗發(fā)現(xiàn)BM6526位點等位基因數(shù)最多（21個）片段大小為152-191 bp，說明BM6526位點變異程度大，對研究山羊選育更有價值。武志娟等［11］利用14個微衛(wèi)星標記分析5個黑山羊群體，發(fā)現(xiàn)其中有11個位點的等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)差異大，認為這種不平衡可能是由于地理隔離和人工選擇導(dǎo)致的。Lin等［12］研究亞洲10個山羊群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，群體離馴養(yǎng)中心越遠，其遺傳多樣性漸漸下降。王可等［13］研究濟寧青山羊4個群體同樣發(fā)現(xiàn)等位基因數(shù)要高于Ne。Hines等［14］認為等位基因分布不均可能與近交有關(guān)。本試驗中15個微衛(wèi)星位點等位基因數(shù)與Ne相差較多，片段大小不同，頻率分布不均勻，說明7個地方山羊群體有豐富的遺傳多樣性。

基因雜合度與品種的變異程度具有正相關(guān)關(guān)系，即基因雜合度越大，品種的變異程度越大［15］。若一個群體的平均雜合度大于0.5，表明該群體的遺傳多樣性豐富［16］。郭丹等［17］利用7個微衛(wèi)星位點分析遼寧絨山羊遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)群體的平均雜合度為0.638，說明遼寧絨山羊品種內(nèi)的遺傳變異處于較高水平，選擇潛力大。趙艷紅［18］分析阿拉善型內(nèi)蒙古絨山羊的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)群體的平均雜合度為0.613 6，同樣說明內(nèi)蒙古絨山羊遺傳多樣性豐富。本研究中，所檢測的群體內(nèi)平均雜合度比較高，說明群體的遺傳變異較大，適應(yīng)環(huán)境的能力較強。并且，不同微衛(wèi)星在同一山羊群體，同一微衛(wèi)星在不同山羊群體中變異程度也有很大差別。BM6526位點的He最高為0.904 7，ILSTS005位點相對其它微衛(wèi)星位點較低為0.482 5；燕山絨山羊最低為0.647 9，內(nèi)蒙古絨山羊的He最高為0.760 2。7個群體中僅太行山羊Ho > He，其他6個群體均是Ho < He，說明除太行山羊外，其他6個群體均存在不同程度的近交，承德無角山羊近交程度高于其他群體。王可等［9］研究濟寧青山羊遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，各標記的觀測雜合度在0.428 6-0.904 8之間，期望雜合度在

0.598 1-0.839 7之間，平均期望雜合度為0.757 4，屬于高度雜合，遺傳變異大。I是研究物種多樣性的指標之一，與群體的遺傳變異程度有正相關(guān)關(guān)系，即I值越大，群體的遺傳變異程度越高［19］。本試驗中，7個地方山羊群體I值均大于1，表明試驗群體遺傳變異程度較高，受近交的影響較小。多態(tài)信息含量（PIC）反映了微衛(wèi)星標記的變異程度和估計群體內(nèi)的遺傳變異程度，PIC < 0.25時為低度多態(tài)，0.25 0.5時為高度多態(tài)［20］，PIC > 0.7時認為是最優(yōu)的遺傳標記［21］。本試驗的15個微衛(wèi)星位點僅有ILSTS005為中度多態(tài)，其余均為高度多態(tài)，有11個微衛(wèi)星位點大于0.7，說明試驗地方山羊群體具有豐富的遺傳基礎(chǔ)，有很大的保種潛力。

圖4 7個地方山羊群體聚類系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 7個地方山羊品種的遺傳距離及聚類分析

Fst反映了群體間的遺傳分化程度，F(xiàn)st在0-0.05時，各群體間遺傳分化很小，在0.05-0.15時，為中等程度的遺傳分化，在0.15-0.25時，為高度遺傳分化；Nm數(shù)值小于1時，群體可能向遺傳分化的方向發(fā)展，Nm數(shù)值大于1時，群體能有效地抑制由遺傳漂變引起的遺傳分化［22］。Radhika等［23］利用 10 個微衛(wèi)星位點分析印度本地山羊和雜交山羊品種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，二者均具有高的遺傳多樣性，并且Fst值為0.02，說明群體間遺傳分化很小。本試驗發(fā)現(xiàn)14個微衛(wèi)星位點在7個山羊群體的Fst值均在0.484以上，說明群體間的遺傳分化程度很大。Nm值均在0.162 7以上，說明7個群體間的基因交流較少。Fit反應(yīng)了總?cè)后w的近交程度，表示整個群體中攜帶的一對等位基因是同源的概率［24］。本試驗Fit值為0.088 3，表明群體間存在8.83%的遺傳變異來自遠交，占的比例相對較小。

遺傳距離表示不同種群或品種間的基因差異程度，通常利用等位基因頻率計算［25］，是研究物種遺傳多樣性的基礎(chǔ)，可反映群體的系統(tǒng)進化，群體分化時間越短，遺傳距離就越小［26］。趙艷紅等［27］分析中國6個山羊群體遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)遼寧絨山羊和內(nèi)蒙古絨山羊（阿拉善型）遺傳距離為0.134，與本試驗的結(jié)果（0.1589）相似。楊清芳［28］利用15個微衛(wèi)星研究5個山羊品種遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，遼寧絨山羊與承德無角山羊的遺傳距離為0.2270，與本試驗研究結(jié)果（0.2341）相似。劉恩民［29］利用SNP芯片分析中國地方山羊品種的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古絨山羊和太行山羊聚在一大類，與本試驗結(jié)果相一致。Alatiyat等［30］利用17個微衛(wèi)星位點UPGMA聚類分析3種沙特山羊發(fā)現(xiàn)，Jabli、Bishi和Tohami聚為一大類。本研究結(jié)果顯示，燕山絨山羊與遼寧絨山羊聚為一類，說明這兩個群體遺傳距離較近，燕山絨山羊與太行山羊遺傳距離為0.268 2，相對于其他群體最遠。

4 結(jié)論

燕山絨山羊、遼寧絨山羊、承德無角山羊、濟寧青山羊、太行山羊、武安山羊和內(nèi)蒙古絨山羊7個地方山羊群體遺傳多樣性豐富，群體間遺傳分化程度大，基因交流少，受近交程度影響小，具有較高的利用價值和潛力。