侯淑玲，朱雅君，劉靜遠(yuǎn)，田沂民，謝小玨，于 翠，葉 軍，易建平

(上海海關(guān)動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135)

橘臀紋粉蚧Planococcuscitris(Risso)又名橘粉蚧，隸屬于同翅目 Homoptera粉蚧科 Pseudococcidae臀紋粉蚧屬Planococcus，是熱帶、亞熱帶植物的主要害蟲[1]，主要為害寄主植物的莖、葉片、花、果等幼嫩部位，輕者可使葉片變黃，重者干枯脫落，嚴(yán)重影響水果的經(jīng)濟(jì)價值和觀賞性植物的品相[2]。同時，橘臀紋粉蚧與另一種重要的檢疫性粉蚧大洋臀紋粉蚧P.minor(Maskell)形態(tài)相近，且常在同一種寄主上混合發(fā)生，極易混淆，區(qū)分兩者難度較大，因此建立快速準(zhǔn)確鑒定橘臀紋粉蚧的方法十分必要。實(shí)時熒光PCR方法相較傳統(tǒng)PCR方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，適用于實(shí)驗(yàn)室對有害生物的快速鑒定。本研究根據(jù)橘臀紋粉蚧穩(wěn)定的特異性片段設(shè)計(jì)實(shí)時熒光Taqman探針，并優(yōu)化反應(yīng)條件，以建立橘臀紋粉蚧實(shí)時熒光PCR快速鑒定方法，實(shí)現(xiàn)對橘臀紋粉蚧的快速鑒定。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

供試樣品材料包括上海市浦東新區(qū)葡萄上采集的橘臀紋粉蚧，上海辰山植物園(簡稱SCSBG)、云南省西雙版納熱帶植物園(簡稱XTBG)蘭花上采集的橘臀紋粉蚧，以及上海海關(guān)(簡稱SHCC)截獲標(biāo)本上的橘臀紋粉蚧。陰性對照為大洋臀紋粉蚧、南洋臀紋粉蚧P.lilacinus(Cockerell)，為上海海關(guān)截獲樣本，具體信息見表1。所有標(biāo)本浸泡于無水乙醇中，保存于上海海關(guān)動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心植檢實(shí)驗(yàn)室-20 ℃冰箱中。

表1 試驗(yàn)材料

1.2 參考序列

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載107條臀紋粉蚧屬線粒體COI基因序列，具體信息見表2。

表2 參考序列信息

1.3 實(shí)時熒光Taqman探針設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件

使用DNeasy?Blood Tissue Kit(Qiagen，Germany)試劑盒從整頭成蟲樣品中提取DNA。PCR引物為PcoF1/LepR1[3]。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括：1 μL DNA模板(10 ng)，引物各1 μL(5 μmol/L)，5 μL dNTPs(10 mmol/L)，5 μL 10×PCR buffer(含有Mg2+，TaKaRa Bio.Dalian，China)，Taq DNA polymerase 2 U，ddH2O 37 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送北京六合華大基因科技有限公司上海分公司測序部雙向測序，測得PCR產(chǎn)物序列長度為678bp。應(yīng)用CLUSTX和GENEDOC軟件將測序所得DNA序列與GenBank中下載序列進(jìn)行整理和比對，尋找橘臀紋粉蚧穩(wěn)定的特異性序列，篩選適合于探針設(shè)計(jì)的片段。

實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增體系為25 μL(TaKaRa，Premix Ex TaqTM試劑盒)：2×Premix Ex Taq 12.5 μL，50×ROX Reference Dye 0.5 μL，上下游引物(5 μmol/L)各1.0 μL，探針(10 μmol/L)1.0 μL，DNA模板2.0 μL，超純水補(bǔ)至25 μL。利用7500 Real-Time PCR System定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5s，60℃ 30s，循環(huán)40次。每份樣品設(shè)置2個重復(fù)，陰性對照為大洋臀紋粉蚧及南洋臀紋粉蚧，空白對照為超純水。

1.4 實(shí)時熒光Taqman靈敏度檢測

將上海辰山植物園采集的樣品CS-1a的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，用數(shù)字進(jìn)行編號，1—7號表示樣品CS-1a DNA模板濃度依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，每個梯度設(shè)置2個重復(fù)，引物及探針、反應(yīng)條件同前，檢測實(shí)時熒光PCR的靈敏度。樣品CS-1a DNA初始濃度為6.33 mg/ μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時熒光Taqman探針設(shè)計(jì)

通過比對橘臀紋粉蚧及幾個近似種的線粒體COI基因序列，最終確定在380 bp左右位置設(shè)計(jì)探針(圖1)。所有探針的熒光標(biāo)記信號均為FAM，引物分別為PCF3/PCR3，具體內(nèi)容見表3(引物和探針由上海基康公司合成)。

表3 橘臀紋粉蚧實(shí)時熒光PCR引物、探針

2.2 實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增

橘臀紋粉蚧特異性探針PC-MGB對供試的24個橘臀紋粉蚧樣品均有強(qiáng)的熒光信號增加曲線，表現(xiàn)為陽性擴(kuò)增，而陰性對照大洋臀紋粉蚧及南洋臀紋粉蚧樣品、空白對照則沒有檢測到熒光信號，表現(xiàn)為陰性，部分樣品擴(kuò)增曲線參照圖2。

2.3 靈敏度

熒光信號曲線如圖3所示，Ct值(Cycle threshold)分別為1號17.68、2號19.95、3號23.90、4號26.92、5號30.62、6號34.53、7號39.48。由于7號的Ct值>35，無法確定是否為陽性。所以，橘臀紋粉蚧特異性探針PC-MGB的檢測限位CS-1a的DNA濃度為6.33×10-5mg/ μL，即63.3 pg/ μL。

3 討論與結(jié)論

由于粉蚧科蟲體小，形態(tài)鑒別特征不明顯，往往需要豐富的經(jīng)驗(yàn)才能準(zhǔn)確鑒定。其種內(nèi)遺傳差異較小，相似度約98.5%—100%，同屬內(nèi)不同種間相似度約85%—93%，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)鑒定粉蚧科昆蟲具有一定的可行性[4]。目前GenBank中有關(guān)粉蚧科的序列數(shù)為3 000余條，種類數(shù)為400余種，相比較粉蚧科全世界1 400余種差距較大，但隨著數(shù)據(jù)庫中序列的不斷增加，能夠鑒定的種類數(shù)將越來越多。許曉東[5]研究了憑祥口岸截獲的11種粉蚧及無花果蠟蚧的COI區(qū)域序列及28SD2區(qū)域序列，任競妹[6]對粉蚧科23屬52種昆蟲進(jìn)行了DNA條形碼測序，研究結(jié)果均顯示DNA條形碼基本可以對粉蚧科昆蟲進(jìn)行有效的物種鑒定。但少數(shù)粉蚧科種內(nèi)遺傳差異較大，如Ferrisiavirgate種內(nèi)序列相似度為95.4%[7]，而Ferrisia屬內(nèi)種間相似度可達(dá)95.9%，因此不能僅僅根據(jù)DNA條形碼技術(shù)對此種類型進(jìn)行最終鑒定，應(yīng)同時輔以形態(tài)學(xué)特征支持。除了DNA條形碼技術(shù)外，Saccaggi等[8]應(yīng)用多重PCR建立了區(qū)分橘臀紋粉蚧、無花果刺粉蚧Planococcusficus(Signoret)和擬長尾粉蚧的方法；Rung等[9]基于RFLP技術(shù)建立了大洋臀紋粉蚧與橘臀紋粉蚧的檢測方法。實(shí)時熒光PCR檢測在植物有害生物快速檢測中是公認(rèn)的一種快速、穩(wěn)定、靈敏度高的方法。該方法多應(yīng)用于病原微生物檢測中，在昆蟲檢測中應(yīng)用相對較少，Jones等[10]建立了區(qū)分B型和Q型煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)的實(shí)時熒光PCR方法；Bass等[11]設(shè)計(jì)了三重?zé)晒馓结樣糜阼b定傳播瘧疾的按蚊及其近似種；另外，已針對5種實(shí)蠅建立了實(shí)時熒光PCR檢測方法[12]。但應(yīng)用實(shí)時熒光PCR技術(shù)進(jìn)行粉蚧科昆蟲鑒定相對較少，徐浪等[13]應(yīng)用熒光PCR方法建立了大洋臀紋粉蚧和南洋臀紋粉蚧的快速檢測方法，為國內(nèi)首次將實(shí)時熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于蚧蟲種類鑒定，本文研究內(nèi)容豐富了該領(lǐng)域研究內(nèi)容，具有一定應(yīng)用價值。

橘臀紋粉蚧與大洋臀紋粉蚧不僅在外部形態(tài)上近似，分子水平上的差異也較小，依據(jù)單個基因位點(diǎn)差異設(shè)計(jì)的特異性探針常易造成假陽性擴(kuò)增，這對橘臀紋粉蚧實(shí)時熒光特異性Taqman探針的設(shè)計(jì)造成一定難度。本試驗(yàn)在設(shè)計(jì)探針之時，選擇了具有4個差異位點(diǎn)區(qū)段，并選擇了其中擴(kuò)增效率較高，同時重復(fù)性好的PCF3/PCR3作為擴(kuò)增引物，檢測準(zhǔn)確度高，分析簡單快捷，可用于基層實(shí)驗(yàn)室橘臀紋粉蚧快速鑒定。且本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)時熒光PCR引物及探針檢測的最低樣本濃度可達(dá)pg級水平，靈敏度較高。值得注意的是，實(shí)際運(yùn)用時若Ct值在35—40，需濃縮待測樣品的DNA濃度，重復(fù)進(jìn)行檢測。