孟 亮 陳謙學(xué) 余小祥 涂 勤 王躍飛 樊 文 羅才奎

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，復(fù)發(fā)率高、病死率高，平均生存時(shí)間只有15個(gè)月左右[1～3]。腫瘤細(xì)胞依據(jù)其表面標(biāo)記蛋白和分化特性，可以分為兩種：第一種為已經(jīng)分化成熟的腫瘤細(xì)胞；第二種具備自我更新和分化為其他細(xì)胞的能力，即腫瘤干細(xì)胞[4，5]。組 蛋 白 去 乙 酰 化 酶（histone deacetylases，HDAC）通過組蛋白的去乙?；ㄈコ阴；笵NA更緊密地纏繞在組蛋白上，從而導(dǎo)致這些DNA不易被基因轉(zhuǎn)錄因子接觸，結(jié)果導(dǎo)致與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期阻滯、腫瘤免疫、受損細(xì)胞凋亡等有關(guān)的蛋白的表達(dá)受到抑制。HDAC抑制劑能選擇性地恢復(fù)這些癌癥抑制因子和其它抗癌基因的表達(dá)，還可以間接地抑制血管生成因子的表達(dá)，幫助阻斷對(duì)腫瘤的血液供應(yīng)[6]；因此，以HDAC 為腫瘤治療靶點(diǎn)獲得了越來越多的關(guān)注。而腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和凋亡等行為，和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖是藥物執(zhí)行抗腫瘤效應(yīng)的主要作用方式之一。本文探討HDAC抑制劑MS-275 對(duì)原代培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞（glioma cell，GC）及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cell，GSC）生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 GSC的分離和鑒定 取術(shù)中切除的腦膠質(zhì)瘤瘤體深部無囊性變、無壞死腫瘤組織標(biāo)本，修剪去除外周壞死組織，無血清培養(yǎng)基沖洗三遍，將組織塊無菌剪成1 cm3大小，經(jīng)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 消化15～20 min，用吸管反復(fù)吹打，沉淀后吸取上清，70 μm 孔徑篩網(wǎng)過濾，除去紅細(xì)胞，以2×105個(gè)活細(xì)胞/ml終濃度接種于培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。從取材到接種在30 min內(nèi)完成。原代培養(yǎng)7 d，待培養(yǎng)基中懸浮的單克隆細(xì)胞團(tuán)形狀規(guī)則、體積較大后，棄去瓶底貼壁細(xì)胞，吸取培養(yǎng)基并離心后棄去半量陳舊培基，重新吹打成單細(xì)胞懸液，并應(yīng)用MiniMACS免疫磁珠分選CD113陽性GSC，采用無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)液（含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白血病抑制因子各20 ng/ml的DMEM/F12）培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×106個(gè)/ml。取100 μl單細(xì)胞懸液，加入2 μl CD133-APC（eBioscience，17-1339-42）或2 μl Nestin-APC（eBioscience，MA5-23650），4 ℃避光孵育45 min。加入400 μl 流式染色緩沖液重現(xiàn)細(xì)胞，避光進(jìn)行流式細(xì)胞儀（杭州艾森，NovoCyte）檢測(cè)。

將細(xì)胞分為4 組：GC 組，GSC 組，GC+MS-275組，GSC+MS-275組；其中，GC組和GSC組不給予藥物處理；GC+MS-275 組和GSC+MS-275 組給予8 mmol/L的MS-275處理24 h。

1.2 HDAC 的檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，預(yù)冷0.01 mol/L PBS（pH 7.2）漂洗2 次，按照Nuclear/Cytosol Fractionation Kit（BioVision，K266-100）說明提取核蛋白，并分別按照Colorimetric HDAC Activity Assay Kit（BioVision，K332）說明操作，最后得到405 nm 波長(zhǎng)處的A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以4×103/ml 接種于96 孔板，每組6 復(fù)孔，每孔加入20 μl MTT（5 g/L）溶液，37 ℃孵育4 h，小心棄去上清液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，微量振蕩器震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處光密度（optic density，OD）值。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞均勻的接種到6孔板中培養(yǎng)24 h。用不含EDTA 的0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞，1 000轉(zhuǎn)/min 離心5 min，去上清，PBS 重懸2次；1 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，去上清，100 μl PBS重懸細(xì)胞，緩慢加入700 μl 預(yù)冷的80%乙醇，使乙醇終濃度為70%4℃固定4 h 以上，1 000 轉(zhuǎn)/min 離心5 min，預(yù)冷PBS潤(rùn)洗2次，加入100 μl RNase（50 μg/ml），37 ℃水浴30 min加入400 μl PI（50 μg/ml），4 ℃避光染色30 min流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)耐藥相關(guān)蛋白表達(dá) 冰面上RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，每5 min振蕩1次，裂解20 min，4 ℃條件下1 5000轉(zhuǎn)/min離心30 min，吸取上清液獲取總蛋白。根據(jù)BCA 蛋白定量結(jié)果上樣，10%SDS-PAGE 凝膠電泳2.5 h，轉(zhuǎn)膜后NC 膜TBS 稍蕩洗，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入ABCG2、MPR1、MPR 4、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗10 min×3 次，室溫孵育二抗1 h，TBST 洗10 min，重復(fù)3 次，曝光顯影。采用BIO-RAD Image Lab 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析；定量資料以±s 表示；采用單因素方差分析；P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSC 鑒定結(jié)果GSC 呈現(xiàn)出Nestin 和CD133 陽性。見圖1。

2.2 MS-275 降低GC 和GSC 的HDAC 水平 與GC 組相比，GC+MS-275 組細(xì)胞HDAC 含量顯著降低（P＜0.05）；與GSC組比較，GSC+MS-275組細(xì)胞HDAC含量顯著降低（P＜0.05）。GSC+MS-275 組細(xì)胞HDAC含量顯著高于GC+MS-275組（P＜0.05）。見圖2。

2.3 MS-275 抑 制GC 和GSC 的增殖 與GC 組相比，GC+MS-275 組細(xì)胞增殖能力顯著降低（P＜0.05）；與GSC 組比較，GSC+MS-275 組細(xì)胞增殖能力顯著降低（P＜0.05）。GSC+MS-275 組細(xì)胞增殖能力顯著高于GC+MS-275組（P＜0.05）。見圖3。

2.4 MS-275 阻滯細(xì)胞周期及促進(jìn)細(xì)胞凋亡 與GC組相比，GC+MS-275 組G0/G1期細(xì)胞比例明顯增高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著增高（P＜0.05）；和GSC組比較，GSC+MS-275 組G0/G1期細(xì)胞比例明顯增高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著增高（P＜0.05）。GSC+MS-275組G0/G1期細(xì)胞比例明顯低于GC+MS-275組（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

2.5 MS-275對(duì)GC 和GSC 耐藥性的影響 與GC 組相比，GC+MS-275 組細(xì)胞MPR4、ABCG2、MPR1、Bax、p-PI3K 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而Bcl2 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與GSC組比較，GSC+MS-275組細(xì)胞MPR4、ABCG2、MPR1、Bax、p-PI3K表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而Bcl2 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。GSC+MS-275 組細(xì)胞ABCG2、MPR1、Bax、p-PI3K 表達(dá)水平顯著高于GC+MS-275 組（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的腫瘤之一，發(fā)病率占腦腫瘤的70%以上，具有惡性程度高和病死率高的特點(diǎn)[6，7]。化療主要是消除成熟的腫瘤細(xì)胞，雖然能使腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少、惡性腫瘤的體積縮小，但腫瘤干細(xì)胞卻對(duì)化療藥物耐藥。另外，所有腫瘤細(xì)胞在放療過程中，在放射線照射下造成的DNA損害是相似的，但腫瘤干細(xì)胞具有更強(qiáng)的DNA修復(fù)功能，這導(dǎo)致放療也不能干預(yù)腫瘤干細(xì)胞的增殖過程[8，9]。臨床上使用的藥物雖然可使瘤體縮小，但是，這些效果通常是暫時(shí)的，也不能明顯地延長(zhǎng)病人的生命；因?yàn)榧仁怪委煼桨缚梢粤盍鲶w在表面上完全消失，但腫瘤干細(xì)胞也會(huì)繼續(xù)增殖分化，促使腫瘤復(fù)發(fā)[10，11]。因此，只有當(dāng)治療方法直接針對(duì)腫瘤干細(xì)胞時(shí)，才可能阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移，并徹底治愈腫瘤。

腫瘤治療失敗的原因之一是腫瘤細(xì)胞逐漸產(chǎn)生了耐藥性；另一個(gè)原因可能是現(xiàn)有的治療方法不能有效地殺滅增殖速度較快的腫瘤干細(xì)胞。HDAC是組蛋白重要的表觀遺傳學(xué)修飾方式。MS-275 作為一種HDAC抑制劑，具有干擾去乙?；腹δ?，可通過有效上調(diào)抑癌基因的表達(dá)、阻斷腫瘤生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞選擇性凋亡，達(dá)到治療腫瘤的目的[12]。和普通抑癌藥物比較，MS-275 具有靶向性好等特點(diǎn)，具有更強(qiáng)的特異性和選擇性，而且其對(duì)癌細(xì)胞的耐藥性有更突出的影響。Kristensen 等[13]發(fā)現(xiàn)當(dāng)乳腺正常導(dǎo)管上皮發(fā)展為導(dǎo)管原位癌時(shí)，組蛋白乙?；斤@著降低，因此認(rèn)為組蛋白乙?；赡茉谌橄倌[瘤進(jìn)展中具有重要作用。本文結(jié)果顯示MS-275顯著降低原代培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和GSCs 中HDAC 水平，提示MS-275對(duì)HDAC具有顯著抑制作用；另外，MS-275促使膠質(zhì)瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并促進(jìn)其凋亡，GSCs雖然具有一定的抵抗作用，但是GSCs凋亡率仍明顯降低。這提示MS-275 能阻斷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡；盡管GSCs對(duì)MS-275有一定耐藥性，但其凋亡率仍然顯著降低。

PI3K/Akt 信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)節(jié)是必要的，是促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖、抗凋亡、促血管生成、化療耐受的重要途徑。多種腫瘤細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路異常，如卵巢癌[14]、乳腺癌[14]、惡性膠質(zhì)瘤[15]、子宮內(nèi)膜癌[16]、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤[17]、骨髓增生異常綜合征[18]等。由于PI3K/Akt信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移有緊密關(guān)系，可能是腫瘤治療及抗腫瘤藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)。本文結(jié)果顯示，MS-275顯著降低原代培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和和GSCs 中p-PI3K/PI3K水平，表明MS-275抑制p-PI3K/Akt 信號(hào)通路。

綜上所述，MS-275促進(jìn)原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞和GSCs 凋亡，同時(shí)抑制細(xì)胞增殖，可能是通過抑制p-PI3K/Akt 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的；但是GSCs 對(duì)MS-275仍然有一定的耐藥性。