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        高效液相色譜法測(cè)定預(yù)混合飼料中的25-羥基維生素D3

        2020-07-09 02:04:44張浩然張亦菲華賢輝
        糧食與飼料工業(yè) 2020年2期
        關(guān)鍵詞:回收率甲醇基質(zhì)

        張浩然,張亦菲,徐 汀,田 愷,華賢輝,商 軍

        (上海市獸藥飼料檢測(cè)所,上海 201103)

        25-羥基維生素D3也叫25-羥膽鈣化(固)醇、鈣二醇或簡(jiǎn)寫(xiě)為25-OH-D3,是維生素D3機(jī)體內(nèi)的第1個(gè)代謝產(chǎn)物,其在肝細(xì)胞微粒體和線粒體中25-羥化酶的作用下,脫氫生成,是維生素D3在血漿循環(huán)中的主要形式[1],因此,與維生素D3相比,更容易被吸收[2]。研究表明,在家禽飼料中添加一定量的25-OH-D3可起到提高家禽的體增重、胸肉率及免疫力等作用[3-4],還能夠提高蛋殼質(zhì)量[5];在豬日糧中添加一定量的25-OH-D3可以改善肉質(zhì),提高母豬懷孕率及窩產(chǎn)仔數(shù)[6-7],其生物學(xué)效價(jià)是維生素D3的2倍[8]。目前,25-OH-D3已獲我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2625號(hào)公告和歐洲食品安全局(EFSA)批準(zhǔn)可以在豬和家禽飼料中使用的新型營(yíng)養(yǎng)型添加劑,并且都規(guī)定了其在配合飼料或全混合日糧中的最高限量:豬為50 μg/kg,肉雞、火雞為100 μg/kg、其他家禽為80 μg/kg[9],其在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中也得到了廣泛的應(yīng)用。

        目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道主要為血清中25-OH-D3含量的測(cè)定[10-13],鮮有飼料中25-OH-D3含量測(cè)定的報(bào)道,配合飼料中添加的25-OH-D3主要來(lái)源于預(yù)混合飼料,有必要建立預(yù)混合飼料中25-OH-D3含量測(cè)定的可靠方法,為此,建立并優(yōu)化了高效液相色譜檢測(cè)方法。

        1 材料與方法

        1.1 試劑和儀器

        25-OH-D3標(biāo)準(zhǔn)品,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.2%,批號(hào)為G155330,德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇為色譜純;試驗(yàn)用水均為一級(jí)水;預(yù)混合飼料樣品來(lái)自于市場(chǎng)收集。ACQUITY Arc高效液相色譜儀,美國(guó)Waters公司,配Empower 3軟件;AB265-S電子天平(精度為0.01 mg),梅特勒-托利多(中國(guó));Molatom 1810A型純水機(jī),重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司。

        1.2 樣品的前處理

        稱取預(yù)混合飼料3 g(精確至0.01 mg)于50 ml棕色容量瓶中,加水10 ml,超聲10 min,待溫度降至室溫后,加入30 ml甲醇,震蕩混勻,超聲提取20 min,冷卻至室溫后,用甲醇定容至刻度。再取30 ml于離心管中,以9 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,取上清液過(guò)0.22 μm濾膜,待上機(jī)。

        1.3 色譜條件

        色譜柱:Thermo AQUASIL-C18,柱長(zhǎng)100 mm,內(nèi)徑3.0 mm,粒徑3 μm;柱溫:30℃;流動(dòng)相:A相為水,B相為甲醇,梯度洗脫程序見(jiàn)表1;檢測(cè)波長(zhǎng) 264 nm;進(jìn)樣量 50 μl。

        1.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液制備

        稱取25-OH-D3標(biāo)準(zhǔn)品25 mg(精確至0.01 mg)至25 ml棕色容量瓶中,振搖使25-OH-D3完全溶解,用甲醇定容。于-20℃下保存。

        1.5 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液制備

        用85%甲醇溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋至棕色容量瓶中,使?jié)舛确謩e為25.00、10.00、5.00、1.00、0.50、0.05 μg/ml。臨用現(xiàn)配。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 色譜分離條件

        根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,高效液相色譜法測(cè)定25-OH-D3多用甲醇和水作流動(dòng)相[14-15]。由于預(yù)混合飼料基質(zhì)復(fù)雜,存在極性較弱的強(qiáng)保留物質(zhì),故本方法采用表1梯度洗脫進(jìn)行分析,確保目標(biāo)分得到有效分離并盡可能縮短分析時(shí)間。此外,本方法不會(huì)受到預(yù)混合飼料中常見(jiàn)的其他脂溶性維生素的干擾,典型色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

        表1 梯度洗脫表

        圖1 25-OH-D3,維生素A,維生素D3及維生素E標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖

        圖2 預(yù)混合飼料樣品溶液的色譜圖

        2.2 提取劑的篩選

        向空白基質(zhì)中進(jìn)行濃度為10 mg/kg的添加,稱取3 g于50 ml容量瓶中,加水10 ml,超聲處理10 min,冷卻至室溫后,選取不同提取劑加入30 ml,超聲提取20 min,冷卻至室溫后,用相應(yīng)提取劑定容至刻度。取30 ml,離心(9 000 r/min,5 min)取上清液(如提取劑與水分層,則取有機(jī)層1 ml,氮吹至干后,用1 ml 85%甲醇復(fù)溶),過(guò)0.22 μm濾膜,上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明,甲醇的回收率為88.9%。將甲醇提取后的殘?jiān)M(jìn)行2次提取,殘?jiān)形礄z出25-OH-D3,說(shuō)明甲醇的提取效率較高,故確定甲醇為提取劑,提取1次,結(jié)果見(jiàn)表2。

        2.3 方法的線性與范圍

        根據(jù)市售預(yù)混合飼料樣品實(shí)際情況,25-OH-D3的含量主要在(2~300)mg/kg。按照本文確定的方法進(jìn)行前處理,得到待測(cè)樣品溶液的濃度在(0.12~18)μg/ml。故本方法選擇濃度為(0.05~25)μg/ml,以濃度(x)為橫坐標(biāo),相應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。線性方程為y= 13 486x-11 670,相關(guān)系數(shù)為0.999 8。結(jié)果表明,本方法在濃度為(0.05~250)μg/ml時(shí),線性良好。

        表2 不同提取劑提取效率考察結(jié)果(n=5)

        2.4 方法的檢測(cè)限和定量限

        在空白基質(zhì)中添加一定濃度的25-OH-D3對(duì)照品,按照本方法的前處理及分析方法進(jìn)行試驗(yàn),并依據(jù)信號(hào)與噪聲比例(s/n),即s/n≥3的濃度為檢出限,s/n≥10的濃度為定量限的原則,確定了本方法的檢出限為0.2 mg/kg,定量限為1 mg/kg,結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

        圖3 空白預(yù)混合飼料基質(zhì)中添加0.2 mg/kg(s/n ≥3)的色譜圖

        圖4 空白預(yù)混合飼料基質(zhì)中添加1 mg/kg(s/n ≥10)的色譜圖

        2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

        考慮到預(yù)混合飼料樣品中25-OH-D3含量分布范圍較大,故選取空白基質(zhì),加入一定濃度25-OH-D3對(duì)照品,分別從1、10、50、200 mk/kg四個(gè)不同濃度水平考查準(zhǔn)確度及精密度。試驗(yàn)結(jié)果表明,4種不同濃度添加的批內(nèi)回收率為72.2%~104.2%,批內(nèi)RSD為1.0%~5.3%;批間回收率為75%~103%,批間RSD為1.3%~4.4%。方法的回收率及精密度均符合GB/T 23182—2008《飼料中獸藥及其他化學(xué)物檢測(cè)試驗(yàn)規(guī)程》要求,結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 方法準(zhǔn)確度及精密度的試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

        2.6 方法的耐用性

        2.6.1柱溫對(duì)測(cè)定的影響

        選擇實(shí)際樣品,25-OH-D3標(biāo)示量為2.5 mg/kg。按照本文的儀器條件,調(diào)整柱溫,在25~35℃考察柱溫對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明,柱溫在25、30及35℃時(shí),測(cè)定的25-OH-D3含量結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%,說(shuō)明柱溫在25~35℃的變化,對(duì)25-OH-D3含量測(cè)定結(jié)果無(wú)影響,結(jié)果見(jiàn)表4。

        表4 不同柱溫對(duì)25-OH-D3含量測(cè)定結(jié)果的影響(n=3)

        2.6.2色譜柱對(duì)測(cè)定的影響

        選擇實(shí)際樣品,25-OH-D3標(biāo)示量為2.5 mg/kg。按照本方法的儀器條件,更換色譜柱,考察不同色譜柱對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明,使用不同色譜柱進(jìn)行測(cè)定時(shí),結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%,表明不同色譜柱對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響,結(jié)果見(jiàn)表5。

        表5 不同色譜柱對(duì)25-OH-D3含量測(cè)定結(jié)果的影響(n=3)

        2.7 方法的基質(zhì)效應(yīng)考察

        2.7.1不同載體對(duì)25-OH-D3含量測(cè)定的影響

        實(shí)際生產(chǎn)中,為了能夠更好承載其活性成分,提高化學(xué)穩(wěn)定性和分散性,25-OH-D3有不同種類(lèi)的飼料載體。因此,應(yīng)考察常見(jiàn)載體對(duì)25-OH-D3含量測(cè)定的影響。選取不同載體進(jìn)行濃度為10 mg/kg的添加,按照本文規(guī)定的方法進(jìn)行試驗(yàn),通過(guò)回收率,考察本方法對(duì)于不同載體中25-OH-D3的提取效率。結(jié)果表明,回收率均大于90%,表明本方法適用于不同載體,結(jié)果見(jiàn)表6。

        2.7.2不同基質(zhì)對(duì)25-OH-D3含量測(cè)定的影響

        市售預(yù)混合飼料種類(lèi)繁雜是其基質(zhì)復(fù)雜的原因之一。應(yīng)對(duì)常見(jiàn)的不同預(yù)混合飼料基質(zhì)進(jìn)行考察,包括豬用、禽用及水產(chǎn)用預(yù)混合飼料。選取不含有25-OH-D3的空白基質(zhì),進(jìn)行濃度為10 mg/kg的添加,按照本研究規(guī)定的方法進(jìn)行試驗(yàn),通過(guò)回收率,考察本方法對(duì)于不同基質(zhì)中25-OH-D3的提取效率。結(jié)果表明,回收率均大于83%,表明本方法適用于不同基質(zhì),結(jié)果見(jiàn)表7。

        表6 不同載體中25-羥基維生素D3提取效率考察數(shù)據(jù)表(n=3)

        表7 不同基質(zhì)中25-羥基維生素D3提取效率考察數(shù)據(jù)表(n=3)

        2.8 樣品測(cè)定

        為了進(jìn)一步考察方法適用性,按本文方法對(duì)市場(chǎng)收集的各類(lèi)預(yù)混合飼料產(chǎn)品進(jìn)行了測(cè)定。為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性,對(duì)收集的共計(jì)16批的禽用及豬用預(yù)混合飼料進(jìn)行了測(cè)定,并對(duì)每個(gè)試樣進(jìn)行了本底加標(biāo)測(cè)定。結(jié)果表明,禽用預(yù)混合飼料的測(cè)定結(jié)果在(3.3~273.5)mg/kg,本底加標(biāo)回收率在86.1%~110.2%;豬用預(yù)混合飼料的測(cè)定結(jié)果為(2.2~81.3)mg/kg,本底加標(biāo)回收率為86.5%~104.1%。表明,建立的方法適用于預(yù)混合飼料中25-OH-D3的測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表8。

        表8 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)表(n=3)

        3 討論

        3.1 關(guān)于前處理的建議

        部分飼料產(chǎn)品為了更好地保護(hù)25-OH-D3會(huì)使用水溶性包被技術(shù),因此,在加水10 ml后一定要充分搖勻,將樣品完全濕潤(rùn),打開(kāi)水溶性包被,從而使25-OH-D3被充分提取,以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

        3.2 關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的建議

        在實(shí)際預(yù)混合飼料產(chǎn)品中,25-OH-D3的含量可能會(huì)相差數(shù)十甚至數(shù)百倍。因此,對(duì)于少量樣品,如果明確其標(biāo)示量,那么可以適當(dāng)縮小標(biāo)準(zhǔn)工作曲線范圍,或者配制濃度相近的單一濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

        4 結(jié)論

        研究結(jié)果表明,所建立方法的檢出限、定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、準(zhǔn)確度與精確度等均能滿足預(yù)混合飼料中25-OH-D3測(cè)定要求。

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