張浩然，張亦菲，徐 汀，田 愷，華賢輝，商 軍

(上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103)

25-羥基維生素D3也叫25-羥膽鈣化(固)醇、鈣二醇或簡(jiǎn)寫(xiě)為25-OH-D3，是維生素D3機(jī)體內(nèi)的第1個(gè)代謝產(chǎn)物，其在肝細(xì)胞微粒體和線粒體中25-羥化酶的作用下，脫氫生成，是維生素D3在血漿循環(huán)中的主要形式[1]，因此，與維生素D3相比，更容易被吸收[2]。研究表明，在家禽飼料中添加一定量的25-OH-D3可起到提高家禽的體增重、胸肉率及免疫力等作用[3-4]，還能夠提高蛋殼質(zhì)量[5]；在豬日糧中添加一定量的25-OH-D3可以改善肉質(zhì)，提高母豬懷孕率及窩產(chǎn)仔數(shù)[6-7]，其生物學(xué)效價(jià)是維生素D3的2倍[8]。目前，25-OH-D3已獲我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2625號(hào)公告和歐洲食品安全局(EFSA)批準(zhǔn)可以在豬和家禽飼料中使用的新型營(yíng)養(yǎng)型添加劑，并且都規(guī)定了其在配合飼料或全混合日糧中的最高限量：豬為50 μg/kg，肉雞、火雞為100 μg/kg、其他家禽為80 μg/kg[9]，其在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中也得到了廣泛的應(yīng)用。

目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道主要為血清中25-OH-D3含量的測(cè)定[10-13]，鮮有飼料中25-OH-D3含量測(cè)定的報(bào)道，配合飼料中添加的25-OH-D3主要來(lái)源于預(yù)混合飼料，有必要建立預(yù)混合飼料中25-OH-D3含量測(cè)定的可靠方法，為此，建立并優(yōu)化了高效液相色譜檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

25-OH-D3標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.2%，批號(hào)為G155330，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇為色譜純；試驗(yàn)用水均為一級(jí)水；預(yù)混合飼料樣品來(lái)自于市場(chǎng)收集。ACQUITY Arc高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司，配Empower 3軟件；AB265-S電子天平(精度為0.01 mg)，梅特勒-托利多(中國(guó))；Molatom 1810A型純水機(jī)，重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司。

1.2 樣品的前處理

稱取預(yù)混合飼料3 g(精確至0.01 mg)于50 ml棕色容量瓶中，加水10 ml，超聲10 min，待溫度降至室溫后，加入30 ml甲醇，震蕩混勻，超聲提取20 min，冷卻至室溫后，用甲醇定容至刻度。再取30 ml于離心管中，以9 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，待上機(jī)。

1.3 色譜條件

色譜柱：Thermo AQUASIL-C18，柱長(zhǎng)100 mm，內(nèi)徑3.0 mm，粒徑3 μm；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A相為水，B相為甲醇，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng) 264 nm；進(jìn)樣量 50 μl。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液制備

稱取25-OH-D3標(biāo)準(zhǔn)品25 mg(精確至0.01 mg)至25 ml棕色容量瓶中，振搖使25-OH-D3完全溶解，用甲醇定容。于-20℃下保存。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液制備

用85%甲醇溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋至棕色容量瓶中，使?jié)舛确謩e為25.00、10.00、5.00、1.00、0.50、0.05 μg/ml。臨用現(xiàn)配。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離條件

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，高效液相色譜法測(cè)定25-OH-D3多用甲醇和水作流動(dòng)相[14-15]。由于預(yù)混合飼料基質(zhì)復(fù)雜，存在極性較弱的強(qiáng)保留物質(zhì)，故本方法采用表1梯度洗脫進(jìn)行分析，確保目標(biāo)分得到有效分離并盡可能縮短分析時(shí)間。此外，本方法不會(huì)受到預(yù)混合飼料中常見(jiàn)的其他脂溶性維生素的干擾，典型色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

表1 梯度洗脫表

圖1 25-OH-D3，維生素A，維生素D3及維生素E標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖

圖2 預(yù)混合飼料樣品溶液的色譜圖

2.2 提取劑的篩選

向空白基質(zhì)中進(jìn)行濃度為10 mg/kg的添加，稱取3 g于50 ml容量瓶中，加水10 ml，超聲處理10 min，冷卻至室溫后，選取不同提取劑加入30 ml，超聲提取20 min，冷卻至室溫后，用相應(yīng)提取劑定容至刻度。取30 ml，離心(9 000 r/min，5 min)取上清液(如提取劑與水分層，則取有機(jī)層1 ml，氮吹至干后，用1 ml 85%甲醇復(fù)溶)，過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明，甲醇的回收率為88.9%。將甲醇提取后的殘?jiān)M(jìn)行2次提取，殘?jiān)形礄z出25-OH-D3，說(shuō)明甲醇的提取效率較高，故確定甲醇為提取劑，提取1次，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 方法的線性與范圍

根據(jù)市售預(yù)混合飼料樣品實(shí)際情況，25-OH-D3的含量主要在(2～300)mg/kg。按照本文確定的方法進(jìn)行前處理，得到待測(cè)樣品溶液的濃度在(0.12～18)μg/ml。故本方法選擇濃度為(0.05～25)μg/ml，以濃度(x)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。線性方程為y= 13 486x-11 670，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。結(jié)果表明，本方法在濃度為(0.05～250)μg/ml時(shí)，線性良好。

表2 不同提取劑提取效率考察結(jié)果(n=5)

2.4 方法的檢測(cè)限和定量限

在空白基質(zhì)中添加一定濃度的25-OH-D3對(duì)照品，按照本方法的前處理及分析方法進(jìn)行試驗(yàn)，并依據(jù)信號(hào)與噪聲比例(s/n)，即s/n≥3的濃度為檢出限，s/n≥10的濃度為定量限的原則，確定了本方法的檢出限為0.2 mg/kg，定量限為1 mg/kg，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 空白預(yù)混合飼料基質(zhì)中添加0.2 mg/kg(s/n ≥3)的色譜圖

圖4 空白預(yù)混合飼料基質(zhì)中添加1 mg/kg(s/n ≥10)的色譜圖

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

考慮到預(yù)混合飼料樣品中25-OH-D3含量分布范圍較大，故選取空白基質(zhì)，加入一定濃度25-OH-D3對(duì)照品，分別從1、10、50、200 mk/kg四個(gè)不同濃度水平考查準(zhǔn)確度及精密度。試驗(yàn)結(jié)果表明，4種不同濃度添加的批內(nèi)回收率為72.2%～104.2%，批內(nèi)RSD為1.0%～5.3%；批間回收率為75%～103%，批間RSD為1.3%～4.4%。方法的回收率及精密度均符合GB/T 23182—2008《飼料中獸藥及其他化學(xué)物檢測(cè)試驗(yàn)規(guī)程》要求，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方法準(zhǔn)確度及精密度的試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.6 方法的耐用性

2.6.1柱溫對(duì)測(cè)定的影響

選擇實(shí)際樣品，25-OH-D3標(biāo)示量為2.5 mg/kg。按照本文的儀器條件，調(diào)整柱溫，在25～35℃考察柱溫對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，柱溫在25、30及35℃時(shí)，測(cè)定的25-OH-D3含量結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%，說(shuō)明柱溫在25～35℃的變化，對(duì)25-OH-D3含量測(cè)定結(jié)果無(wú)影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同柱溫對(duì)25-OH-D3含量測(cè)定結(jié)果的影響(n=3)

2.6.2色譜柱對(duì)測(cè)定的影響

選擇實(shí)際樣品，25-OH-D3標(biāo)示量為2.5 mg/kg。按照本方法的儀器條件，更換色譜柱，考察不同色譜柱對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，使用不同色譜柱進(jìn)行測(cè)定時(shí)，結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%，表明不同色譜柱對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響,結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同色譜柱對(duì)25-OH-D3含量測(cè)定結(jié)果的影響(n=3)

2.7 方法的基質(zhì)效應(yīng)考察

2.7.1不同載體對(duì)25-OH-D3含量測(cè)定的影響

實(shí)際生產(chǎn)中，為了能夠更好承載其活性成分，提高化學(xué)穩(wěn)定性和分散性，25-OH-D3有不同種類的飼料載體。因此，應(yīng)考察常見(jiàn)載體對(duì)25-OH-D3含量測(cè)定的影響。選取不同載體進(jìn)行濃度為10 mg/kg的添加，按照本文規(guī)定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)回收率，考察本方法對(duì)于不同載體中25-OH-D3的提取效率。結(jié)果表明,回收率均大于90%，表明本方法適用于不同載體，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.7.2不同基質(zhì)對(duì)25-OH-D3含量測(cè)定的影響

市售預(yù)混合飼料種類繁雜是其基質(zhì)復(fù)雜的原因之一。應(yīng)對(duì)常見(jiàn)的不同預(yù)混合飼料基質(zhì)進(jìn)行考察，包括豬用、禽用及水產(chǎn)用預(yù)混合飼料。選取不含有25-OH-D3的空白基質(zhì)，進(jìn)行濃度為10 mg/kg的添加，按照本研究規(guī)定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)回收率，考察本方法對(duì)于不同基質(zhì)中25-OH-D3的提取效率。結(jié)果表明，回收率均大于83%，表明本方法適用于不同基質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 不同載體中25-羥基維生素D3提取效率考察數(shù)據(jù)表(n=3)

表7 不同基質(zhì)中25-羥基維生素D3提取效率考察數(shù)據(jù)表(n=3)

2.8 樣品測(cè)定

為了進(jìn)一步考察方法適用性，按本文方法對(duì)市場(chǎng)收集的各類預(yù)混合飼料產(chǎn)品進(jìn)行了測(cè)定。為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)收集的共計(jì)16批的禽用及豬用預(yù)混合飼料進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)每個(gè)試樣進(jìn)行了本底加標(biāo)測(cè)定。結(jié)果表明，禽用預(yù)混合飼料的測(cè)定結(jié)果在(3.3～273.5)mg/kg，本底加標(biāo)回收率在86.1%～110.2%；豬用預(yù)混合飼料的測(cè)定結(jié)果為(2.2～81.3)mg/kg，本底加標(biāo)回收率為86.5%～104.1%。表明，建立的方法適用于預(yù)混合飼料中25-OH-D3的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)表(n=3)

3 討論

3.1 關(guān)于前處理的建議

部分飼料產(chǎn)品為了更好地保護(hù)25-OH-D3會(huì)使用水溶性包被技術(shù)，因此，在加水10 ml后一定要充分搖勻，將樣品完全濕潤(rùn)，打開(kāi)水溶性包被，從而使25-OH-D3被充分提取，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3.2 關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的建議

在實(shí)際預(yù)混合飼料產(chǎn)品中，25-OH-D3的含量可能會(huì)相差數(shù)十甚至數(shù)百倍。因此，對(duì)于少量樣品，如果明確其標(biāo)示量，那么可以適當(dāng)縮小標(biāo)準(zhǔn)工作曲線范圍，或者配制濃度相近的單一濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，所建立方法的檢出限、定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、準(zhǔn)確度與精確度等均能滿足預(yù)混合飼料中25-OH-D3測(cè)定要求。