鄭世浩，程琪，包永明

(大連理工大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 盤錦 124221)

生態(tài)農(nóng)業(yè)是新時代中國農(nóng)業(yè)發(fā)展的核心?；瘜W(xué)肥料雖然可大幅增加糧食產(chǎn)量和收益，但是土壤生態(tài)環(huán)境及可持續(xù)耕種問題迫切需要解決[1]。雖然中國出臺農(nóng)作物秸稈還田等鼓勵政策，但是腐化時間長、病蟲害等諸多技術(shù)障礙限制這一土壤生態(tài)工程的推廣應(yīng)用[2]。使用生物菌肥，不僅能降低或替代化學(xué)肥料的使用，而且可有效利用秸稈，減肥增效。

復(fù)合微生物菌肥中含有多類微生物。固氮菌具備生物固氮作用，即微生物經(jīng)過體內(nèi)的固氮酶將空氣中的N2還原為NH3被植物直接利用，為作物的生長提供氮素[3]。釋磷菌能將作物生長基質(zhì)中難以利用的磷轉(zhuǎn)化成可利用的形態(tài)，從而提高植物對磷的利用[4]。釋磷菌分為釋放不溶性無機磷細菌和水解有機磷細菌2種。釋放不溶性無機磷細菌通過產(chǎn)生有機酸使難溶磷化物溶解；水解有機磷細菌則是通過酶的作用水解有機磷化物[5]。生防菌能以生物防治的方法來控制植物病原菌所導(dǎo)致的植物病害，芽孢桿菌自身能產(chǎn)生芽孢，且抗逆性較強，是一類常見的生防菌種[6-7]。

農(nóng)林廢棄物秸稈資源巨大，制備秸稈微生物菌肥實現(xiàn)秸稈還田是秸稈資源化利用的有效手段。甄靜等[8]利用玉米秸稈，通過黑曲霉、枯草芽孢桿菌和毛栓孔菌發(fā)酵制備微生物菌肥，有效促進玉米秸稈的降解及土壤養(yǎng)分含量的提升；尹爽等[9]利用玉米秸稈發(fā)酵S-3菌株與白腐菌，使秸稈中的纖維素和木質(zhì)素有效降解。目前，利用秸稈制備微生物菌肥多為秸稈高效降解，如何提高氮、磷營養(yǎng)成分以及防治病害等問題還未得到解決。本研究的微生物菌肥圍繞秸稈有效資源化，不僅通過沼液厭氧處理以及里氏木霉腐化的方式使玉米秸稈高效降解，同時還通過固態(tài)發(fā)酵的方式使具有高效固氮、解磷、生物防治作用的菌株在玉米秸稈中大量生長，施用后能為栽培作物持續(xù)提供充足的氮、磷營養(yǎng)元素并對植物病害進行防治對策。在秸稈發(fā)酵過程中不添加任何化學(xué)試劑，資源化利用過程高效、易行，對環(huán)境友好，且成本低廉，更加具備實用價值。

本研究從植物根際土壤中分別篩選出具有高效固氮、釋放不溶性無機磷和水解有機磷能力的菌株，將它們與能拮抗層出鐮孢菌的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌混合，以秸稈為基質(zhì)進行固態(tài)發(fā)酵，通過單因素試驗和響應(yīng)面法得到固態(tài)發(fā)酵營養(yǎng)體最高活菌數(shù)的適宜條件，制備出一種新型多效微生物菌肥。同時，利用制備的復(fù)合微生物菌肥栽培試驗，通過對生長指標(biāo)和抗病特性的測定，檢驗其應(yīng)用效果。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究中菌種篩選所用土壤來自大連理工大學(xué)盤錦校區(qū)；玉米秸稈：沈陽市渾南區(qū)營城子街道；沼液：大連理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院贈送；里氏木霉(Trichodermareesei)、層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌KY2(BacillusmethylotrophicusKY2)：大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院贈送。

實驗儀器：酶標(biāo)儀SpectraMax M2e(美國Molecular Devices)；全自動凱氏定氮儀VELP UDK 159(意大利VELP)；立式全溫振蕩培養(yǎng)箱ZQPL-200(天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋SX-700(日本TOMY)；6202型小型高速粉碎機(北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司)等。

培養(yǎng)基：① Ashby培養(yǎng)基(無氮源)：10.0g·L-1葡萄糖，0.2 g·L-1MgSO4·7H2O，5.0 g·L-1CaCO3，0.2 g·L-1NaCl，0.2 g·L-1KH2PO4，1.0 g·L-1CaSO4·2H2O，pH 7.0。

② Pikovskaya培養(yǎng)基：10.0 g·L-1葡萄糖，0.3 g·L-1NaCl，0.3 g·L-1KCl，0.3 g·L-1MgSO4·7H2O，0.03 g·L-1MnSO4·4H2O，0.5 g·L-1(NH4)2SO4，5.0 g·L-1Ca3(PO4)2，0.03 g·L-1FeSO4·7H2O，pH 7.0。

③ 蒙金娜培養(yǎng)基：10.0 g·L-1葡萄糖，0.3 g·L-1KCl，0.3 g·L-1NaCl，0.5 g·L-1(NH4)2SO4，0.03 g·L-1MnSO4·4H2O，0.3 g·L-1MgSO4·7H2O，0.03 g·L-1FeSO4·7H2O，2.0 g·L-1植酸鈣，pH 7.0。

④ LB培養(yǎng)基：5.0 g·L-1酵母浸粉，10 g·L-1NaCl，10.0 g·L-1蛋白胨，pH 7.5。

⑤ PDA培養(yǎng)基：20.0 g·L-1葡萄糖，20.0 g·L-1馬鈴薯，pH自然。

制作瓊脂培養(yǎng)基時需外加15 g·L-1瓊脂。

1.2 固氮、釋磷、生防菌株的篩選

將10 g土樣添加至裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，30 ℃，150 r·min-1條件下在立式全溫振蕩培養(yǎng)箱中恒溫振蕩培養(yǎng)2 h制備土壤懸液；按1%接種量，分別接種于100 mL Ashby，蒙金娜和Pikovskaya培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃，150 r·min-1條件下在立式全溫振蕩培養(yǎng)箱中恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，重復(fù)2次，進行富集培養(yǎng)。培養(yǎng)液梯度稀釋后在Ashby培養(yǎng)基，蒙金娜培養(yǎng)基和Pikovskaya培養(yǎng)基的平板上分別接種0.1 mL的懸浮液，每組試驗重復(fù)3次。培養(yǎng)5 d后，通過菌落的大小和形狀在Ashby培養(yǎng)基篩選固氮菌[10-11]。通過在蒙金娜培養(yǎng)基和Pikovskaya培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生透明圈大小，篩選釋磷菌[12-13]。

根據(jù)平板對峙培養(yǎng)法，在PDA培養(yǎng)基中心點接種直徑3 mm的層出鐮孢菌，在周圍距離45 mm處點接種生物防治菌株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌KY2，以無菌水處理作空白對照，每組試驗重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，待對照組層出鐮孢菌長滿全部培養(yǎng)基時，測量抑菌直徑評估拮抗效果[14]。

1.3 固氮、釋磷能力的測定

將活化好的固氮菌、水解有機磷細菌、釋放不溶性無機磷細菌分別接種至Ashby培養(yǎng)基、蒙金娜培養(yǎng)基和Pikovskaya培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)120 h；每隔12 h，利用酶標(biāo)儀SpectraMax M2e測定菌株發(fā)酵液的OD600，觀察菌株的生長情況。

取1 mL固氮菌發(fā)酵液，利用全自動凱氏定氮儀VELP UDK 159測定總氮含量的變化[15]；取1 mL釋磷菌發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心8 min，取上清液，按照國標(biāo)法(GB 11893—89—鉬銻抗比色法)測定可溶性磷含量的變化。

1.4 菌種鑒定

用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株DNA。PCR體系(50 μL)：DNA模板2 μL，正反向引物各1 μL，dNTP 4 μL，10× PCR 緩沖液5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 36.8 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min 30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物送至北京華大基因公司測序，結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫。

1.5 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.2 Central Composite Design 響應(yīng)面設(shè)計試驗 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取溫度、接種量、初始pH值為考察因素，有效活菌數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面試驗。采用Design-Expert 10.0軟件，確定溫度、接種量、初始pH值的響應(yīng)面試驗因素水平和編碼，以四種菌株的活菌數(shù)為指標(biāo)設(shè)計20組試驗。模型對有效活菌數(shù)進行二次多元回歸擬合，得到響應(yīng)面圖，確定最佳發(fā)酵參數(shù)，同時，對該模型進行方差分析，檢驗其可信度[17]。

表1 單因素優(yōu)化條件Table 1 Single factor optimization conditions

1.6 復(fù)合微生物菌肥指標(biāo)測定

利用模型優(yōu)化的發(fā)酵條件制備復(fù)合型生物菌肥，對預(yù)測結(jié)果進行驗證；同時，按照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 798-2015測定復(fù)合型生物菌肥的有機質(zhì)、總氮、有效磷、總磷、pH、有效活菌數(shù)、雜菌率、有效期。

1.7 復(fù)合微生物菌肥煙草盆栽試驗

1.7.1 復(fù)合微生物菌肥對煙草光合生理和基質(zhì)營養(yǎng)成分的影響 依據(jù)栽種煙草土壤基質(zhì)的不同設(shè)計5組試驗：CK：珍珠巖57 g、泥炭土150 g；C0：珍珠巖19 g、泥炭土188 g；C1：珍珠巖57 g、泥炭土145 g，復(fù)合微生物菌肥5 g；C2：珍珠巖57 g、泥炭土140 g，復(fù)合微生物菌肥10 g；C3：珍珠巖57 g、泥炭土120 g，復(fù)合微生物菌肥30 g，每組試驗重復(fù)5次。

試驗處理：將煙草種子在育苗盤中培養(yǎng)14 d；選取粗壯的、生長狀況較好的幼苗移栽入試驗分組設(shè)計出的盆栽中，每組試驗設(shè)置5組平行，每盆中均栽種長勢一致的幼苗，生長40 d后，使用CIRAS2測定系統(tǒng)測定煙草盆栽在10：00時的凈光合速率(Pn)，氣孔導(dǎo)度(Gs)，蒸騰速率(E)和胞間二氧化碳濃度(Ci)，連續(xù)重復(fù)3天。根據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 798-2015測定盆栽基質(zhì)中的有機質(zhì)、總氮、有效磷、總磷和總有效活菌數(shù)。

1.7.2 復(fù)合微生物菌肥在煙草生物防治中的應(yīng)用 依據(jù)栽種煙草土壤基質(zhì)的不同設(shè)計4組試驗：CK：泥炭土450 g；C1：泥炭土445 g，復(fù)合微生物菌肥5 g；C2：泥炭土440 g，復(fù)合微生物菌肥10 g；C3：泥炭土420 g，復(fù)合微生物菌肥30 g。每組試驗重復(fù)5次。

試驗處理：將煙草種子在育苗盤中培養(yǎng)14 d；選取粗壯的、生長狀況較好的幼苗移栽入試驗分組設(shè)計出的盆栽中，每組試驗設(shè)置3組平行，每盆中均栽種長勢一致的幼苗。生長40 d后時，觀察煙草生長情況，然后接種層出鐮孢菌，并于生長60 d時按照GB/T 23222—2008煙草病蟲害分級及調(diào)查方法進行了煙草層出鐮孢菌枯萎病發(fā)病情況調(diào)查。發(fā)病率= (發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100%；病情指數(shù)=[∑(各級病株株數(shù)×該病級值) /(調(diào)查總株數(shù)×最高級值)]×100%；防治效果=[(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)) /對照病情指數(shù)×100%。

1.8 數(shù)據(jù)分析

固氮、解磷能力的表征實驗所得數(shù)據(jù)利用Origin 2018進行制圖。Central Composite Design設(shè)計試驗采用Design-Expert 10.0軟件，模型利用F檢驗進行顯著性分析，顯著水平為P<0.05。盆栽試驗結(jié)果采用SPSS 19.0進行單因素方差分析，Tukey法進行多重比對，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定結(jié)果

利用Ashby，蒙金娜和Pikovskaya培養(yǎng)基富集篩選得到固氮菌N3、水解有機磷細菌Y1和釋放不溶性無機磷細菌W3；16S rDNA測序?qū)⑵浞謩e鑒定為Arthrobactersp.ZSH N3(MN007137)，EnterobacterasburiaeZSH Y1(MN007138)，EnterobacterhormaecheiZSH W3(MN007139)(系統(tǒng)發(fā)育樹略)。固氮菌N3、水解有機磷細菌Y1、釋放不溶性無機磷細菌W3是首次報道，共同登錄號為SUB5714815，在CGMCC的菌種保藏號分別為1.184 71、1.184 70、1.184 69。

2.2 固氮、解磷能力的表征

如圖1A、1D所示，固氮菌N3在LB、無氮Ashby平板上生長狀況良好，菌落呈黃色圓形；在Ashby液體培養(yǎng)基中生長20 hOD600值達到0.72，并且保持穩(wěn)定，5天內(nèi)的固氮量達到126.30 mg·L-1(圖2A)。

A、B、C為LB培養(yǎng)基；D、E、F分別為Ashby，蒙金娜和Pikovskaya培養(yǎng)基。A,B,and C were LB media; D,E,and F were Ashby,Monkina,and Pikovskaya medium,respectively.

如圖1B、1E所示，水解有機磷細菌Y1在蒙金娜平板上的溶磷圈直徑可達22.5 mm。在液體培養(yǎng)基中生長24 hOD600值達到1.051，并且保持穩(wěn)定，5 d內(nèi)的溶磷量達到420.11 mg·L-1(圖2B)。

如圖1C、1F所示，釋放不溶性無機磷細菌W3在Pikovskaya平板上的溶磷圈直徑可達到18.0 mm。在液體培養(yǎng)基中生長36 hOD600值達到1.523，并且保持穩(wěn)定，在5 d內(nèi)的溶磷量達到513.19 mg·L-1(圖2C)。

圖2 菌株N3、Y1、W3固氮、解磷能力的測定Fig.2 Determination of nitrogen fixation and soluble phosphate-solubilizing ability of N3,Y1 and W3 strains

2.3 生防菌株的篩選

通過平板對峙法，如圖3所示，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌KY2對于層出鐮孢菌具有良好的拮抗效果。

A：對照組 層出鐮孢菌單獨生長7 d；B、C、D：試驗組 KY2與層出鐮孢菌分別共同生長1 d、4 d、7 d。接種在平板中央的為層出鐮孢菌，兩側(cè)為KY2。A:CK group Fusarium proliferatum grew alone for 7 days.B,C,D:Experimental group KY2 and Fusarium proliferatum grew together for 1 d,4 d,and 7 d,respectively.Among them,Fusarium proliferatum was inoculated in the center of the plate,and KY2 strain was on the both sides.

2.4 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵條件的單因素分析 如圖4所示，N3、Y1、W3和KY2這4株菌的適宜發(fā)酵溫度、含水量和接種量分別為30～35 ℃、100%～120%和8%～12%；里氏木霉與4株菌的接種間隔時間的響應(yīng)區(qū)間為24～36 h，4株菌活菌數(shù)隨發(fā)酵時間的增加先快速上升最后趨于平緩，在發(fā)酵120 h后達到最大值，且保持穩(wěn)定。實際發(fā)酵中可采用氣相雙動態(tài)固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器，對發(fā)酵過程中溫度、含水量、pH值、接種量進行實時調(diào)控[18]。

誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，線上字母表示同一菌株的有效活菌數(shù)在不同條件下的差異，P<0.05。The error bars indicate standard deviation,and the letters on the lines indicate the difference in the effective viable number of the same strain under different conditions,P<0.05.

2.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用星點設(shè)計原理，在初始含水量100%、接種間隔24 h、發(fā)酵120 h的前提下，選擇發(fā)酵溫度A、接種量B和初始pHC3個因素為自變量，以N3、Y1、W3和KY2的有效活菌數(shù)對數(shù)值為指標(biāo)R1、R2、R3、R4，具體方案及結(jié)果如表2所示。

響應(yīng)面設(shè)計數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Design-Expert 10.0對表1中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合,得到發(fā)酵溫度、接種量和初始pH與N3、Y1、W3和KY2的有效活菌數(shù)對數(shù)值之間的二次多元回歸方程，分別為：

R1=9.35-0.009 5A+0.011B-0.006C-0.009AB-0.005 5AC-0.001 25BC-0.003 25A2-0.014B2-0.011C2，

R2=9.44-0.021A+0.036B+0.006 7C+0.006 9AB+0.001AC-0.008BC-0.013A2-0.005 3B2-0.003 2C2，

R3=8.85-0.022A+0.024B-0.003 337C-0.002 1AB-0.014AC+0.003 9BC-0.029A2-0.031B2+0.023C2，

R4=9.45-0.017A+0.029B-0.001 6C-0.002 1AB-0.013AC+0.003 4BC-0.015A2-0.005B2-0.007 8C2。

回歸方程系數(shù)r1=0.951 8、r2=0.952 2、r3=0.948 2、r4=0.953 1，校正決定系數(shù)r1adj=0.908 3、r2adj=0.909 1、r3adj=0.901 6、r4adj=0.910 9，r>0.9說明該模型能精準(zhǔn)的預(yù)測實際情況，radj>0.9說明該模型擬合程度較好，且預(yù)測值和實測值間具有高度的相關(guān)性，因此上述模型合理可用。

對上述回歸模型進行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。4組回歸方程模型顯著性檢驗均P<0.000 1，模型回歸極顯著，具有可信度。

根據(jù)回歸方程，通過Design-Expert 10.0軟件分析，得到回歸模型存在最大值點，即3個影響因素的最佳取值為溫度30.4 ℃、接種量15.5%、初始pH值為7.8時，N3、Y1、W3和KY2有效活菌數(shù)最大估計值分別為2.20×109、2.92×109、7.19×108和3.02×109CFU·g-1。

2.5 復(fù)合微生物菌肥指標(biāo)的測定

根據(jù)響應(yīng)面預(yù)測出的發(fā)酵條件：溫度30.4 ℃、初始pH 7.8、初始含水量100%、接種量15.5%、接種間隔時間24 h、發(fā)酵時間120 h，對產(chǎn)品進行驗證。由表4所示，N3、Y1、W3和KY2的實際活菌數(shù)分別為2.27×109、3.11×109、7.10×108和3.21×109CFU·g-1，實際值與預(yù)測值基本吻合。

表2 Central composite design試驗結(jié)果 Table 2 Experimental results of Central composite design

表3 響應(yīng)面回歸模型F檢驗效應(yīng)分析Table 3 F-test effect analysis of response surface regression model

續(xù)表Continuing table

表4 復(fù)合微生物菌肥的產(chǎn)品分析Table 4 Product analysis for multi-effects microbial fertilizer

2.6 復(fù)合微生物菌肥對栽培煙草光合作用的影響

煙草栽培40 d時，C2組的煙草葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率顯著高于其他試驗組，胞間二氧化碳濃度顯著低于其他試驗組(表5)。說明復(fù)合微生物菌肥能促進煙草的光合作用，在土肥比為15∶1時，煙草葉片處光合速率最高，煙草的光合作用最強，生長情況最佳。

表5 栽培煙草光合作用指標(biāo)Table 5 Photosynthetic index of cultivated tobacco

2.7 復(fù)合微生物菌肥對盆栽基質(zhì)營養(yǎng)成分的影響

由表6可知，本研究中C2、C3處理的盆栽基質(zhì)中第40 天時總有效活菌數(shù)可達到7.9×107CFU·g-1和1.12×108CFU·g-1，顯著高于未添加復(fù)合微生物菌肥的CK、C0處理。通過平板計數(shù)中菌落形態(tài)得知，本研究復(fù)合微生物菌肥中所含有的多功能菌株能夠協(xié)同生長，并作為優(yōu)勢菌群進一步發(fā)揮作用。復(fù)合微生物菌肥顯著增加盆栽基質(zhì)中的氮和磷的含量，C3處理的盆栽基質(zhì)中的總氮、總磷和有效磷分別增加了0.9%、0.42%和0.23%，顯著高于CK、C0；C2處理的盆栽基質(zhì)在栽培前后總氮和有效磷分別增加了0.56%和0.22%，驗證了除復(fù)合微生物菌肥自身富含的氮、磷營養(yǎng)元素外，復(fù)合微生物菌肥中含有大量微生物還能在自身生長代謝過程中為植物提供養(yǎng)分。

表6 盆栽基質(zhì)營養(yǎng)成分分析Table 6 Nutrients analysis of pot experiment soil

2.8 復(fù)合微生物菌肥在煙草生物防治中的應(yīng)用

由表7可知，60 d時不同處理下的煙草對層出單胞菌的防治效果，對照組CK的全部發(fā)病，試驗組C3的發(fā)病率最低(10%)，防治效果達到了91.17%。

表7 栽培煙草的層出鐮孢菌枯萎病的防治效果Table 7 Control effect of Fusarium proliferatum wilt on cultivated tobacco

3 結(jié)論與討論

3.1 固態(tài)發(fā)酵制備復(fù)合微生物菌肥的優(yōu)勢

微生物菌肥產(chǎn)品的制備方法分為液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵，液態(tài)發(fā)酵的優(yōu)勢主要包括發(fā)酵設(shè)備完善，自動化程度高，產(chǎn)品穩(wěn)定性好，芽孢存活率較高等；缺點是動力消耗大，非芽孢菌活性低，儲存期端，原料要求高。固態(tài)發(fā)酵具備液態(tài)發(fā)酵所不具備的特點，如發(fā)酵過程中消耗的資源量少，對環(huán)境友好，廢棄物利用率高，多菌種混合菌株產(chǎn)品的存活率高，對發(fā)酵設(shè)備需求低等等。隨著水資源的節(jié)約力度日益增加，以及國家對生態(tài)環(huán)保的日漸重視，固態(tài)發(fā)酵理應(yīng)成為菌肥制備的首要選擇。李玉洋等[19]采用菌糠為原材料固態(tài)發(fā)酵多粘類芽孢桿菌SH15，144 h時活菌數(shù)可達5.02×109CFU·g-1；秦宇軒等[20]對優(yōu)化了解淀粉芽孢桿菌L-H15的固態(tài)發(fā)酵工藝，144 h時最大活菌數(shù)可達1.68×1010CFU·g-1；王攀等[21]利用餐廚垃圾廢液液態(tài)發(fā)酵圓褐固氮菌、巨大芽孢桿菌的方法制備微生物菌劑，有效活菌數(shù)最高可達2×108CFU·g-1。相比較而言，固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵效果更佳。

本研究篩選得到固氮菌N3(Arthrobactersp.ZSH N3)、水解有機磷細菌Y1(EnterobacterasburiaeZSH Y1)、釋放不溶性無機磷細菌W3(EnterobacterhormaecheiZSH W3)均是新報道的功能菌株，混合培養(yǎng)不拮抗，表現(xiàn)出良好的中性同生或互生關(guān)系；以玉米秸稈為主要原料建立優(yōu)化的混合固態(tài)發(fā)酵工藝，每克復(fù)合菌肥產(chǎn)品中3種細菌有效活菌數(shù)都在109以上，高于國家標(biāo)準(zhǔn)近3個數(shù)量級，達到目前研究范圍內(nèi)的較高水平；同時，復(fù)合微生物菌肥產(chǎn)品還具有功能多元化的特點，菌肥中總氮和有效磷含量分別為原材料的6.07倍和11.43倍，不僅固氮、釋磷功效強，還兼具生物防治作用，體現(xiàn)了固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)勢，也可擴展應(yīng)用到其他固體廢棄物原料，可進一步進行產(chǎn)業(yè)化推廣[22]。

3.2 復(fù)合微生物菌肥對盆栽基質(zhì)營養(yǎng)成分的影響

張迎春等[23]研究了微生物菌肥對萵筍及土壤性質(zhì)的影響，土壤中的有機質(zhì)隨微生物菌肥的增加而增加，充分施用微生物菌肥后土壤總氮增加了0.8%，土壤總磷增加了0.65%，土壤有效磷增加了0.13%。本研究制備的復(fù)合微生物肥料中有機質(zhì)含量為56.63%，使用后極大提高盆栽土壤基質(zhì)中有機質(zhì)的含量，并作為營養(yǎng)物質(zhì)供固氮菌、釋磷菌、生防菌等微生物進行生長代謝，持續(xù)提高復(fù)合菌肥功效。

周登博等[24]通過盆栽接種試驗探究了甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在香蕉根際土壤的定殖能力，接種第10 d活菌數(shù)最大值為6.67×106CFU·g-1，25 d后活菌數(shù)為2.05×106CFU·g-1，趨于穩(wěn)定。微生物的定殖能夠增進盆栽基質(zhì)中團狀結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，延緩肥料中營養(yǎng)物質(zhì)的溢出，從而增進基質(zhì)的保肥保水性，減少氮的損失。復(fù)合微生物肥料含有大量的固氮、解磷微生物，固氮菌能以生物固氮的方式為作物提供氮素，解磷菌可在基質(zhì)營養(yǎng)供給不足時加速難溶磷元素的活化[22]。復(fù)合微生物菌肥可以顯著增加盆栽基質(zhì)中的有機質(zhì)、總氮、有效磷，能進一步生成和分解基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)和有效成分，固定更多氮素，并將基質(zhì)內(nèi)難溶的磷分解，供植物吸收[23]。

本研究制備的復(fù)合微生物菌肥，不但含有大量有機質(zhì)，改善土壤基質(zhì)的營養(yǎng)成分，而且菌肥中的多功能菌株能夠互相協(xié)同，組合成優(yōu)勢菌群大量定殖，持續(xù)發(fā)揮固氮、釋磷、生防功能，盆栽煙草試驗證明，復(fù)合微生物菌肥能夠顯著促進煙草生長，顯著增加盆栽土壤基質(zhì)中的營養(yǎng)成分含量以及總有效活菌數(shù)，效果顯著，具有較高的應(yīng)用價值。

3.3 復(fù)合微生物菌肥在煙草生物防治中的應(yīng)用

層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)是一種可引起土傳多種植物枯萎病的重要病原菌[25]。目前，利用生物防治技術(shù)應(yīng)對層出鐮孢菌植物病害的研究日益完善，汪軍等[25]研究出枯草芽孢桿菌BLG010對病原尖孢層出鐮孢菌FOC的最大抑菌率達到71.08%；殷曉敏等[26]研究出的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌XG-1對西瓜層出鐮孢菌枯萎病的防治效果可達90%。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌既可以通過分泌幾丁質(zhì)酶、抗菌蛋白等產(chǎn)物與病原菌拮抗，還能誘導(dǎo)植物自身產(chǎn)生過氧化氫酶、多酚氧化酶等抗性物質(zhì)，是一種良好的生防菌[24-26]。

本研究制備的復(fù)合微生物菌肥對層出鐮孢菌引起的煙草枯萎病防治效果可達91.17%，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌KY2在盆栽基質(zhì)中的定殖起到了重要的作用。

綜上，玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵制備復(fù)合微生物菌肥是秸稈資源化利用的有效途徑，施用復(fù)合微生物菌肥既能有效提高栽培土壤基質(zhì)的營養(yǎng)成分含量、改善盆栽基質(zhì)的微生物群落結(jié)構(gòu)，促進煙草作物的生長及光合作用；同時，可有效防治煙草層出鐮孢菌枯萎病。