陳嘉潔，王夢(mèng)珂，付曉政，李瑞，趙特，周琳

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南省新型農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.河南省綠色農(nóng)藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州450002)

20世紀(jì)80年代首次在酵母細(xì)胞的液泡膜上發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)運(yùn)輸H+的三磷酸腺苷酶，命名為液泡型H+-ATP酶(Vacuolar-type proton ATPase)，簡(jiǎn)稱(chēng)V-ATP酶[1]。V-ATP酶是一種多亞基蛋白復(fù)合物，由V1和V0兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。V1結(jié)構(gòu)域包括A、B、C、D、E、F、G和H共8個(gè)亞基，負(fù)責(zé)ATP的水解；V0結(jié)構(gòu)域包括a、c、c′、c″、d和e共6個(gè)亞基，負(fù)責(zé)質(zhì)子的轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。V-ATP酶是一種真核細(xì)胞的陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶，廣泛存在于原生質(zhì)膜和細(xì)胞器的內(nèi)膜系統(tǒng)，包括核內(nèi)體、高爾基體、溶酶體及網(wǎng)格蛋白包被囊泡等，對(duì)維持細(xì)胞器的酸性環(huán)境具有重要作用[3]。它能酸化所有真核細(xì)胞的亞細(xì)胞間隔和高等生物某些特殊組織的細(xì)胞外環(huán)境，為細(xì)胞各種生理活動(dòng)提供最佳的pH值[3-4]。如在骨骼中，破骨細(xì)胞利用V-ATP酶為骨吸收創(chuàng)造一個(gè)至關(guān)重要的局部酸性環(huán)境；在附睪中，V-ATP酶酸化腔室這一過(guò)程對(duì)精子正常成熟和儲(chǔ)存至關(guān)重要[5]。昆蟲(chóng)V-ATP酶主要存在于馬氏管、中腸、唾液腺等的上皮細(xì)胞質(zhì)膜上[6-7]，在腸道堿化、營(yíng)養(yǎng)吸收和離子調(diào)控中發(fā)揮重要功能[8]。近年來(lái)，對(duì)昆蟲(chóng)V-ATP酶的結(jié)構(gòu)與功能研究取得了一定進(jìn)展，且研究表明V-ATP酶在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。通過(guò)RNAi技術(shù)沉默黑胸大蠊PeriplanetafuliginosaB亞基，其幼蟲(chóng)生長(zhǎng)受到抑制，并表現(xiàn)出明顯的蛻皮缺陷[9]；利用RNAi技術(shù)沉默東方粘蟲(chóng)MythimnaseparataV-ATP酶H亞基，試驗(yàn)組黏蟲(chóng)出現(xiàn)發(fā)育緩慢、體型減小的現(xiàn)象[10]。果蠅Drosophilamelanogaster、粉虱Triboliumcastaneum、豌豆蚜Acyrthosiphonpisum、煙草天蛾Manducasexta[11]和玉米根螢葉甲Diabroticavirgiferavirgifera[12]通過(guò)攝取V-ATP酶E亞基dsRNA，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量部分下調(diào)，幼蟲(chóng)致死率顯著上升 ，這表明干擾V-ATP酶E亞基正常表達(dá)對(duì)昆蟲(chóng)是致命的。

棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera(Hübner)屬鱗翅目夜蛾科，是一種全球性農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)，多食且分布廣泛，具有較強(qiáng)的繁殖和環(huán)境適應(yīng)能力，其寄主植物高達(dá)20多科200余種[13]，包括棉花、小麥、玉米和花生等農(nóng)作物以及蘋(píng)果、棗樹(shù)、辣椒和番茄等果樹(shù)和蔬菜[14-15]，在棉花、玉米和蔬菜等重要作物生產(chǎn)中造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[16]。棉鈴蟲(chóng)在中國(guó)各地均有發(fā)生，且世代較多，內(nèi)蒙及新疆地區(qū)每年發(fā)生3代，北方地區(qū)每年發(fā)生3～4代，長(zhǎng)江流域及華南地區(qū)每年發(fā)生5～6代，個(gè)別地區(qū)如云南每年可發(fā)生7代。隨著棉鈴蟲(chóng)對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)劑和Bt棉抗性的產(chǎn)生和發(fā)展，其防治難度越來(lái)越大，因此，尋找并挖掘新的防治靶標(biāo)顯得尤為重要。本研究通過(guò)克隆V-ATP酶E亞基，并采用熒光定量技術(shù)對(duì)該亞基基因在棉鈴蟲(chóng)整個(gè)發(fā)育期及不同組織中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，以便進(jìn)一步深入研究V-ATP酶在棉鈴蟲(chóng)生命過(guò)程中的作用，為V-ATP酶可否作為防治棉鈴蟲(chóng)的潛在靶標(biāo)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx(chóng) 棉鈴蟲(chóng)為河南省新型農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的室內(nèi)種群，飼養(yǎng)條件為溫度(26 ± 1)℃、光照周期14 L∶10 D、相對(duì)濕度60%～85%。飼喂人工飼料，人工飼料的配制和養(yǎng)蟲(chóng)器具的消毒參照梁革梅等[17]的方法。

1.1.2 試劑及儀器 Trizol Reagent購(gòu)自Ambion公司，凝膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒購(gòu)自Takara公司，TA克隆試劑盒及大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司，質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購(gòu)自Solarbio公司。采用儀器有DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠(chǎng))、InGeniusLHR凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司)、Infinite M2000 PRO酶標(biāo)儀(Tecan公司)、QuantStudio 3 Real-Time PCR System(美國(guó)ABI公司)等。引物合成和測(cè)序工作由鄭州擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 棉鈴蟲(chóng)總RNA的提取和cDNA的合成 供試材料為棉鈴蟲(chóng)卵、1～5齡整頭幼蟲(chóng)、預(yù)蛹期幼蟲(chóng)、雌蛹、雄蛹、雌蛾、雄蛾，處于交配期雌雄成蟲(chóng)的觸角、頭(去除觸角)、胸(去除翅和足)、腹節(jié)(去除外生殖器)、足、翅、外生殖器(雌性產(chǎn)卵器和雄性交配器)以及4齡幼蟲(chóng)的中腸。蟲(chóng)體和組織液氮研磨后按照Trizol法提取總RNA，提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和酶標(biāo)儀檢測(cè)濃度后放入-80 ℃保存?zhèn)溆?。基因克隆和熒光定量PCR所用的cDNA模板按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)制備。

1.2.2 棉鈴蟲(chóng)V-ATP酶E亞基的基因克隆 從棉鈴蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組中獲得V-ATP酶E亞基的核苷酸序列，利用DNAMAN9軟件在其開(kāi)放閱讀框序列兩端設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物HAE-F和HAE-R(表1)，以合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL PCR反應(yīng)體系：2×MasterMix 25 μL，10 μmol·L-1正反向引物各2 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。離心混勻后放入PCR儀。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，切膠后的回收產(chǎn)物與T載體連接轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，氨芐抗性篩選陽(yáng)性克隆，挑取白色單菌落進(jìn)行菌液PCR，將正確的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并酶切鑒定目的片段。檢測(cè)成功的質(zhì)粒送鄭州擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 將得到的測(cè)序結(jié)果拼接成全長(zhǎng)序列，使用NCBI的Blast程序進(jìn)行不同物種間的同源性比較，用DNAMAN9軟件進(jìn)行基因一致性分析，用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 7.0分析不同物種間V-ATP酶E亞基的進(jìn)化關(guān)系，用ProtParam軟件進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及蛋白的親疏水性等理化性質(zhì)分析，用SOPMA軟件預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，用Phyre 2軟件預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

表1 RT-PCR及熒光定量PCR反應(yīng)所用引物Table 1 List of primers used in RT-PCR and qRT-PCR reactions

1.2.4 熒光定量PCR 根據(jù)棉鈴蟲(chóng)V-ATP酶E亞基基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異熒光定量PCR引物QG-F和QG-R，為了消除樣本的差異，以GAPDH為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)上下游引物GAPDH-F和GAPDH-R(表1)，參照熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。12 μL反應(yīng)體系：TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)6 μL、10 μmol·L-1正反向引物各0.5 μL、cDNA模板1 μL、OX Reference Dye Ⅱ 0.24 μL、ddH2O 3.76 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃預(yù)變性2 min；兩步法95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn)95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后收集Ct值。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt公式法計(jì)算，ΔCt樣品=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt參照樣品。采用EXCEL計(jì)算各重復(fù)平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，組間比較采用單因素方差分析和鄧肯式新復(fù)極差法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及生物信息學(xué)分析

通過(guò)特異性引物HAE-F和HAE-R擴(kuò)增出棉鈴蟲(chóng)V-ATP酶E亞基，獲得E亞基的開(kāi)放閱讀框序列。測(cè)序結(jié)果顯示，序列全長(zhǎng)681 bp，編碼226個(gè)氨基酸，其核苷酸序列如圖1所示，并翻譯成對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，5′端起始密碼子ATG和3′端終止密碼子TAA已用黑色方框標(biāo)出。

圖1 棉鈴蟲(chóng)V-ATP酶 E亞基基因的核苷酸和氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of V-ATPase subunit E gene of Helicoverpa armigera

氨基酸同源性分析結(jié)果表明，棉鈴蟲(chóng)V-ATP酶E亞基氨基酸序列與斜紋夜蛾Spodopteralitura、粉紋夜蛾Trichoplusiani的一致性分別高達(dá)92%和91%，與其他鱗翅目昆蟲(chóng)一致性也較高，表明該基因在進(jìn)化上較為保守。不同昆蟲(chóng)V-ATP酶E亞基氨基酸序列N末端前70位完全保守，差異主要存在于中間大約100～200位(圖2)。將棉鈴蟲(chóng)與其他昆蟲(chóng)的E亞基氨基酸序列進(jìn)行比較，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)，可以看出棉鈴蟲(chóng)V-ATP酶E亞基與斜紋夜蛾、粉紋夜蛾聚集在同一進(jìn)化枝上，表明它們親緣關(guān)系最近。

表2 不同昆蟲(chóng)V-ATP酶 E亞基氨基酸同源性分析Table 2 Holomogy analysis of amino acid sequences of V-ATPase subunit E gene of different insects %

圖3 不同昆蟲(chóng)V-ATP酶E亞基氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of V-ATPase subunit E in different insects

預(yù)測(cè)棉鈴蟲(chóng)V-ATP酶E亞基的蛋白相對(duì)分子量約為26.1 kD，理論等電點(diǎn)pI為8.30，親水性平均系數(shù)GRAVY為-0.501，表明E亞基是一個(gè)親水性蛋白。通過(guò)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖4)可以發(fā)現(xiàn)，E亞基由72.12%的α-螺旋(Alpha helix)、14.60%的無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)、9.29%的延伸鏈(Extended strand)和3.98%的β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)組成，在整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋是最主要的結(jié)構(gòu)元件。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖5)結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)由一個(gè)長(zhǎng)的α-螺旋和一個(gè)松散的球狀蛋白構(gòu)成，其空間結(jié)構(gòu)主要包含 α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲兩種元件。

注：α-螺旋，藍(lán)色；無(wú)規(guī)則卷曲，紫色；延伸鏈，紅色；β-轉(zhuǎn)角，綠色。Note:Blue is used for alpha helix; Purple for random coil; Red for extended strand; and green for beta turn.

圖5 棉鈴蟲(chóng)V-ATP酶E亞基蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 The protein tertiary structure prediction of V-ATPase subunit E of Helicoverpa armigera

2.2 棉鈴蟲(chóng)V-ATP酶E亞基基因的表達(dá)分析

以棉鈴蟲(chóng)卵V-ATP酶E亞基基因表達(dá)量作為基準(zhǔn)含量，進(jìn)行不同發(fā)育階段的基因表達(dá)分析。結(jié)果表明(圖6)，V-ATP酶E亞基在棉鈴蟲(chóng)各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)且表達(dá)量存在差異。5齡幼蟲(chóng)的表達(dá)量最高，蛹期的表達(dá)量最低。基因表達(dá)量從卵到幼蟲(chóng)期逐漸增加，預(yù)蛹期基因表達(dá)量出現(xiàn)大幅度降低，蛹期繼續(xù)減少，成蟲(chóng)期有所增加。

以棉鈴蟲(chóng)雌蛾翅部V-ATP酶 E亞基基因表達(dá)量作為基準(zhǔn)含量，進(jìn)行不同組織的基因表達(dá)分析。結(jié)果表明(圖7)，V-ATP酶E亞基在棉鈴蟲(chóng)各個(gè)組織均有表達(dá)，其中，在中腸內(nèi)的表達(dá)量最高，為其他組織中表達(dá)量的3-25倍；而在雌蛾腹節(jié)的表達(dá)量最低。在成蟲(chóng)中，以觸角的表達(dá)量為最高，且雄蛾觸角表達(dá)量顯著高于雌蛾；雌雄成蟲(chóng)其他組織中表達(dá)差異不明顯。

圖6 V-ATP酶E亞基基因在棉鈴蟲(chóng)不同發(fā)育階段的表達(dá)量Fig.6 The relative expression levels of the V-ATPase subunit E gene in different developmental stages of Helicoverpa armigera

圖7 V-ATP酶E亞基基因在棉鈴蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)量Fig.7 The relative expression levels of the V-ATPase subunit E gene in different tissues of Helicoverpa armigera

3 討論

V-ATP酶的E亞基和G亞基組成EG-異二聚體(EG-heterodimers)，該二聚體在V1和V0結(jié)構(gòu)域組裝及解離過(guò)程中具有重要作用[18]。本研究成功獲得了棉鈴蟲(chóng)V-ATP酶E亞基基因，氨基酸序列與近源物種V-ATP酶E亞基具有很高同源性，表現(xiàn)出高度的保守性。MARSHANSKY等人[19]解析了釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeV-ATP酶E亞基的蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)E亞基含有一個(gè)長(zhǎng)的N末端α-螺旋(110個(gè)氨基酸)和一個(gè)球狀C末端，本研究預(yù)測(cè)的棉鈴蟲(chóng)V-ATP酶E亞基的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與上述研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，V-ATP酶E亞基在棉鈴蟲(chóng)不同發(fā)育階段及組織中均有表達(dá)?；虮磉_(dá)量與昆蟲(chóng)發(fā)育階段的能量代謝高低呈正相關(guān)，幼蟲(chóng)期取食量大，各項(xiàng)生理生命活動(dòng)旺盛，需要V-ATP酶的參與，基因表達(dá)量均較高；昆蟲(chóng)在卵和蛹期幾乎沒(méi)有活動(dòng)量，亦不需進(jìn)食，積蓄能量為后期孵化和羽化做準(zhǔn)備，故基因表達(dá)量較低；到成蟲(chóng)時(shí)期表達(dá)量再次升高，可能與成蟲(chóng)的飛行、交配等活動(dòng)需要耗能有關(guān)。已有研究表明，V-ATP酶在昆蟲(chóng)中腸離子轉(zhuǎn)運(yùn)生理學(xué)中起著核心作用，中腸含有多種與消化食物、吸收養(yǎng)分有關(guān)的蛋白酶，V-ATP酶通過(guò)水解ATP產(chǎn)生能量，將中腸腸腔中的H+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，同時(shí)將K+運(yùn)送至腸腔中，以維持中腸適宜的pH環(huán)境而保證蛋白酶的活性[20]。中腸V-ATP酶還能堿化原生質(zhì)膜，并為氨基酸的吸收提供能量。昆蟲(chóng)中腸杯狀細(xì)胞頂端膜中存在高密度的V-ATP酶[4]，并已從中腸獲得大量(以毫克量計(jì)算)純化的V-ATP酶[21]。本研究結(jié)果顯示，棉鈴蟲(chóng)中腸的表達(dá)量顯著高于其他組織，這與上述研究結(jié)果一致。另外，V-ATP酶在信號(hào)通路的直接調(diào)節(jié)中起作用[22]，觸角作為感覺(jué)系統(tǒng)的重要組成部分，進(jìn)行著大量的神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)，本研究中棉鈴蟲(chóng)觸角中的基因表達(dá)量較高，推測(cè)其在昆蟲(chóng)的聯(lián)絡(luò)、覓食和交配等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。

V-ATP酶在棉鈴蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，是一個(gè)具有潛力的防治靶標(biāo)，可利用基因編輯工具對(duì)V-ATP酶進(jìn)行更深入的功能挖掘和機(jī)理研究，為相關(guān)抑制劑及新農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供重要參考，以探索害蟲(chóng)防治的新思路。