呼明闖,章宏祥，周發(fā)友，高 攀，唐曉磊

精索靜脈曲張是指精索靜脈叢的靜脈發(fā)生異常曲折和擴張，是導致男性不育的因素之一。正常男性人群中精索靜脈曲張的發(fā)生率約15%，其中40%導致不育[1]。精索靜脈曲張可導致精子中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平增加，從而產(chǎn)生氧化應激。許多研究[2-3]均表明精索靜脈曲張病人的血清、精液、睪丸組織中的氧化應激水平升高。當然還有一些其他因素，如微量元素、Y染色體微缺失等[4-7]。

有研究[2,8-11]表明，線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的缺陷與男性不育有關，某些線粒體基因中單核苷酸多態(tài)性和缺失與精子質(zhì)量低下有關。mtDNA最常見的病理變化是4 977 bp片段的重排或缺失，其中有研究[12-13]報道在前列腺癌等疾病中存在4 977 bp片段的缺失，4 977 bp片段缺失還是衰老和線粒體功能障礙的標志。隨著機體老化，4 977 bp片段的缺失也在人類的組織中逐漸累積，并與人類精子的死亡率增加、生育能力下降有關聯(lián)[14-15]。線粒體DNA中4 977 bp片段基因發(fā)生缺失的位置在8 483～13 459 bp之間，而該片DNA中包涵了ATPase 6/8、COⅢ、ND3、ND4L和ND4等許多結構基因和6個tRNA基因。這些DNA片段編碼的蛋白是呼吸酶，其DNA缺失會導致ATP生成缺陷。因此,本研究擬對精索靜脈曲張在不育病人的精子mtDNA 4 977 bp片段缺失中的分布情況加以研究，以期驗證其與不育的關系。

1 資料與方法

1.1 材料 HAM′S F10液清洗(購自Sigma公司)；DNA試劑盒(購自Tiangen公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成、純化；DNA ladder、PCR mix擴增試劑(購自賽默飛公司)；瓊脂糖和TAE電泳緩沖液均購自索萊寶公司。

1.2 研究對象 選取皖南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院2015年3月至2017年8月泌尿男科門診病人，其中經(jīng)篩選60例患有精索靜脈曲張的不育病人(精索靜脈曲張組)和90名健康人(對照組)納入研究。2組一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)，具有可比性。精索靜脈曲張根據(jù)其彩超特點進行分級：Ⅲ級(大，從病人陰囊表皮處可觀察到)，Ⅱ級(中等大小，無需用瓦爾薩爾試驗就可探及)，Ⅰ級(小，需用瓦爾薩爾試驗才可探及)[16]。收集所有病人和對照組具體的既往史，包括職業(yè)、吸煙酗酒史、腹部手術史。所有病人和對照組禁欲5 d后手淫法收集精液樣本。所有納入研究的對象均書面知情同意。本研究獲得皖南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院單位倫理委員會批準。

表1 2組研究對象的基本資料比較

△示t值

1.3 標本收集 精液樣本在37 ℃液化，然后分成體積為一次射精量的等份試樣，根據(jù)WHO 1999年的標準檢測精子的濃度和形態(tài)。等待至少30 min直到精液液化，梯度離心收獲精子。收獲的精子用HAM′S F10液清洗，后再3 000 r/min離心5 min，棄上清液，即得精子。

1.4 精子總DNA抽提 用哺乳動物細胞DNA試劑盒抽提每份精子標本的總DNA，所得的DNA須符合最佳光密度比A260/A280=1.8及以上，然后儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR 為檢測在總DNA中有mtDNA，而且存在4 977 bp片段的mtDNA缺失，設計了2對引物。引物序列為MT1 (1 257～1 279):5′ -TAT ACC GCC ATC TTC AGC AAA C-3′，MT2 (1 433～1 411):5′ -TAC TGC TAA ATC CAC CTT CGA C-3′ 和D1(8 416～8 437):5′-CCT TAC ACT ATT CCT CAT CAC C-3 ′，D2 (13 519～13 498):5′-TGT GGT CTT TGG AGT AGA AAC C-3 ′，分別用于檢測有無mtDNA和有無4 977 bp片段 DNA缺失[17]。通過位于高度保守的12S區(qū)域的一個177 bp長的序列的擴增可確定總DNA中存在mtDNA，通過缺失區(qū)域側翼的一個127 bp長的產(chǎn)物可確定存在4 977 bp片段 DNA缺失。PCR的反應體系為：20 ng的基因組DNA，25 μL 2×PCR mix、10 pmol上下游引物各1 μL,補足水至總反應體積50 μL。PCR運行體系為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s、60.5 ℃退火45 s、72 ℃延伸30 s，此三步30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴增完成后，取6 μL PCR產(chǎn)物，加1 μL 6×Loading buffer，在緩沖液為1×TAE、2.5 %瓊脂糖中電泳。然后在紫外燈下顯影。所有存在模糊不清的標本均進行重復以保證結果質(zhì)量。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用χ2檢驗和t檢驗。

2 結果

結果顯示，有2條條帶，大小分別為127 bp和177 bp(見圖1)。所有DNA樣本用mtDNA12S區(qū)域引物擴增均成功得到產(chǎn)物，大小為177 bp的條帶證實了在總DNA中有mtDNA的存在，大小為127 bp的條帶擴增自mtDNA缺失的4 977 bp片段。電泳結果顯示，60例精索靜脈曲張組病人中有52例病人的精子mtDNA存在4 977 bp片段的缺失，而90例對照組中4例存在4 977 bp片段的缺失(χ2=104.03，P<0.01)。在81.66%的患有精索靜脈曲張的不育病人和4.44%的健康人存在DNA 4 977 bp片段的缺失，結果顯示，mtDNA 4 977 bp片段的缺失與精索靜脈曲張導致的不育有關聯(lián)(OR=139.80，95%CI=40.08～487.30，P<0.01)。

3 討論

本次研究表明，精索靜脈曲張病人中精子mtDNA 4 977 bp片段缺失的頻率比健康人更高，而且精子中這一DNA片段的缺失可能會導致病人不育。CHEN等[7]研究表明，患有精索靜脈曲張的不育病人、亞臨床精索靜脈曲張的不育病人和健康年輕男性的精子mtDNA 4 977 bp片段的缺失頻率分別為41.3%、17.7%和1.67%。

精子功能障礙被認為是導致男性不育的最主要的原因。mtDNA中ATP生成基因的突變會影響精子的活動能力，而精子的活動能力低下是不育的重要影響因素，因此mtDNA的突變可能會損害精子的活動能力[18]。線粒體最早被發(fā)現(xiàn)與男性不育存在關聯(lián)始于20世紀90年代早期，當時的研究者報道在精子活動能力降低的男性中存在線粒體結構缺陷[18]。mtDNA突變在男性精液的病理變化中發(fā)生了重要作用，在精子活動能力低下和不育的男性病人的精子中存在更多的mtDNA基因缺失[8]。感染、不良生活習慣(如吸煙)和環(huán)境因素(如環(huán)境污染、輻射)等許多因素會增加ROS的生成。由于精索靜脈曲張病人的睪丸靜脈中白細胞DNA 8-OHdG的水平比外周靜脈中的水平高，從而睪丸經(jīng)脈中會產(chǎn)生更多的活性自由基[7]。

DNA對氧化損傷很敏感，精子的DNA遭受嚴重氧化損傷時可能會導致不育[17-18]。精子的膜表面富含多聚不飽和脂肪酸，因此極易受到氧化損傷。過量的ROS會誘導氧化應激，從而同時損傷精子的核DNA和mtDNA。

mtDNA的缺失可能會導致多重呼吸鏈的缺陷[2,17]。有缺陷的呼吸酶，包括由缺失的DNA片段編碼的蛋白亞基可能會促進活性自由基的生成。mtDNA中缺失的4 977 bp片段中包括了多個編碼呼吸酶的基因，這些基因的缺失可能與精子活動能力的降低和男性不育有關聯(lián)。精索靜脈曲張，同時ROS生成增加，會導致精子mtDNA的突變，最終導致不育。由于精索靜脈曲張恢復正常后，會促進抗氧化劑的生成，并減少精子中的氧化應激，從而可能會促進男性的生育力。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)精子mtDNA中4 977 bp片段的缺失與精索靜脈曲張導致的不育存在一定程度的相關。佐證了精子線粒體DNA片段缺失是精索靜脈曲張導致不育的一種重要因素。然而，尚需更大樣本量的研究來確認精子mtDNA中4 977 bp片段的缺失與精索靜脈曲張導致的不育的關聯(lián)。