朱 清，李 楠，武 俠，黃園莉，唐明洋，吳禮高

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一種上皮性惡性腫瘤，是最常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤之一[1]。脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidinetriad,Fhit)基因是活躍的第一位脆性位點(diǎn)的抑癌基因，它對于腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展起著重要的負(fù)性調(diào)控作用，在多種腫瘤中都有不同程度的表達(dá)缺失且具有相關(guān)性[2]。RNA 激活(RNA activation，RNAa)系將靶向目的基因啟動子區(qū)域的雙鏈RNA分子(dsRNA)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，RNAa是小雙鏈RNA引導(dǎo)的Argonaute蛋白參與的轉(zhuǎn)錄基因激活機(jī)制，這種小雙鏈RNA被稱為小激活RNA(saRNA)[3]。本研究檢測Fhit基因在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其與臨床病理因素的相關(guān)性，擬運(yùn)用 RNA 激活上調(diào)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株(Ishikawa,ISK)中Fhit基因的表達(dá)，探討其對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和侵襲、遷移能力的影響?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 實(shí)驗(yàn)組為子宮內(nèi)膜癌組織，術(shù)后均經(jīng)常規(guī)病理組織檢查證實(shí)為Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌(即子宮內(nèi)膜樣腺癌)。選自2018年1月至2019年7月就診的135例病人，年齡27～81歲。根據(jù)2000年FIGO標(biāo)準(zhǔn)，臨床病理分期為Ⅰ～ Ⅱ期70例，Ⅲ～Ⅳ期65例。根據(jù)2003年WHO標(biāo)準(zhǔn)，病理分級為高分化44例，中分化58例，低分化33例。肌層浸潤>50%者69例，≤50%者66例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者43例，無轉(zhuǎn)移者92例。術(shù)前未接受抗癌性治療，具有完整臨床資料。對照組為正常子宮內(nèi)膜組織，選自婦科活檢內(nèi)膜組織或因其他良性疾病而行子宮切除的40例病人。所有組織均來自蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 自動切片機(jī)將蠟塊切成0.4 μm 厚度的切片，脫蠟后在121 ℃枸櫞酸鹽溶液中進(jìn)行3 min的抗原修復(fù)，自然冷卻后在3%的H2O2溶液中靜置10 min，加抗Fhit兔抗人一抗60 ℃ 1 h，PBS沖洗3×5 min，二抗37 ℃ 30 min，PBS沖洗后DAB顯色，鏡下觀察。Fhit蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì),以抗體在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為陽性信號，對細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分比綜合評分[4]。按染色強(qiáng)度打分：0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，按陽性細(xì)胞所占百分比打分:無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞≤10%為1分，陽性細(xì)胞11%～50%為2分，陽性細(xì)胞51%～75%為3分，陽性細(xì)胞>75%為4分；染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積≥2分為免疫反應(yīng)陽性，<2分為表達(dá)下降或免疫反應(yīng)陰性。用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行圖像分析，積分吸光度(integrated optical density，IOD)/面積值作為判斷Fhit 蛋白表達(dá)情況。

1.3 細(xì)胞株及主要試劑 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株ISK、構(gòu)建Fhit-saRNA表達(dá)載體、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑盒(上海吉瑪)；DMEM(高)培養(yǎng)液、PBS平衡液、胎牛血清(Hyclone)；Fhit抗體(Abcam,ab181004)；β-actin 抗體(Abcam,ab8229)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000、Trizol 試劑(Invitrogen) ；CCK-8試劑、Transwell小室(碧云天)；結(jié)合基質(zhì)膠(Matrigel，BD)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將ISK細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，每2～3天傳代一次，傳代時(shí)棄去舊培養(yǎng)液，用PBS洗滌2～3次，加入胰酶消化，加入培養(yǎng)液吹打細(xì)胞，重置細(xì)胞液接種于培養(yǎng)瓶。實(shí)驗(yàn)取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.5 saRNA的序列設(shè)計(jì)及合成 saRNA序列為dsFhit:5′-CGA ATT CGC CCT TGC TTA TTA-3′；5′-AAT TGG CCA TTA GCC GCG GCG-3′；Control:5′-GGC CTT AAG GCC TAA TGC TGC-3′；5′-TTA ACC GGG ATT AGC CGG CAT-3′。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 轉(zhuǎn)染前按2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種6孔板，待細(xì)胞密度達(dá) 70%～80%時(shí)開始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟按 lipofentamineTM2000 試劑說明書進(jìn)行，dsFhit 的終濃度為50 nmol/L，孵育48 h，將 dsFhit 轉(zhuǎn)染入ISK細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染 dsFhit)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染無序RNA)、空白對照組(不轉(zhuǎn)染)。

1.7 Western blotting蛋白免疫印跡法 轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞提取蛋白，用10% 聚丙烯胺凝膠分離蛋白。配制分離膠和積層膠，每孔加入等量蛋白樣本電泳、封閉。將膜放入稀釋的一抗(1∶3 000稀釋)中，溫和振蕩2 h后置于4 ℃冰箱中過夜，置于TBST溶液中洗膜3×10 min，在二抗中溫和振蕩2 h，置于TBST溶液中洗膜3×10 min。將膜用顯影溶液處理后曝光，顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。

1.8 RT-PCR檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)準(zhǔn)確定量。取5 μg 總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Fhit 基因上游引物：5′-AGG ACT CCG AAG AGG TAG CAT-3′，下游引物：5′-TCA CTG AAA GTA GAC CCG CAG-3′；β-actin上游引物：5′-AAC AAG ATG AGA TTG CCA TGC-3′，下游引物：5′-AGT GGG GTG GCT TTT AGG ATA-3′；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃變性3 min后，按下列參數(shù)循環(huán)35次：95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，最后72 ℃孵育10 min。取 5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳30 min，在紫外燈下觀察 DNA 條帶，拍照，并用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。

1.9 CCK-8法 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/毫升，接種于96孔板中，每孔種150 μL細(xì)胞液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后轉(zhuǎn)染，于24、48、72、96、120 h向各孔內(nèi)分別加入20 μL的CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀在450 nm處測定各孔的吸光度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn) 侵襲實(shí)驗(yàn)將結(jié)合基質(zhì)膠每孔50 μL均勻地鋪在 Transwell小室膜上，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，將各組細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/毫升，取200 μL細(xì)胞懸液至Transwell小室中，將小室置于24孔板的培養(yǎng)基中，孵育24 h后取出Transwell小室，用棉簽擦掉濾膜上層細(xì)胞，將濾膜用甲醇固定，加適量結(jié)晶紫溶液染色，于400倍目鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)膜隨機(jī)不同視野透過膜的細(xì)胞數(shù)，取平均值，每組平行設(shè)3個(gè)小室，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室膜上不鋪結(jié)合基質(zhì)膠，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色 結(jié)果顯示，正常子宮內(nèi)膜組織中的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有陽性染色表達(dá)，子宮內(nèi)膜癌組織中的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)陽性染色表達(dá)減弱甚至缺失，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見圖1和表1)。

表1 Fhit在不同組織中的表達(dá)

2.2 Fhit的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理因素的關(guān)系 子宮內(nèi)膜癌中Fhit表達(dá)陽性率FIGO分期Ⅲ+Ⅳ高于FIGO分期Ⅰ+Ⅱ、肌層浸潤>1/2高于肌層浸潤≤1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)，陽性率與年齡無明顯相關(guān)性(P>0.05)(見表2)。

2.3 Western blotting檢測 與子宮內(nèi)膜癌相比，正常子宮內(nèi)膜中Fhit蛋白表達(dá)顯著增高(見圖2)。2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表3)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后與陰性對照組和空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)組Fhit蛋白表達(dá)顯著增高(見圖3)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表4) 。

2.4 RT-PCR 檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后實(shí)驗(yàn)組mRNA表達(dá)水平為0.86±0.15，顯著高于陰性對照組的0.34±0.01和空白對照組的0.33±0.01(P<0.01)。

2.5 dsFhit對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞活性的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染 24、48、72、96、120 h 抑制率分別為5.3%、15.6%、37.2%、43.3%和54.8%，與陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖減慢，生長明顯受抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖4)。

2.6 dsFhit對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲和遷移的影響 Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的侵襲和遷移能力有明顯下降(P<0.01)(見表5、圖5)。

表2 Fhit表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的聯(lián)系

分組Fhit相對表達(dá)量tP子宮內(nèi)膜癌組織正常子宮內(nèi)膜組織0.44±0.020.80±0.0211.06<0.01

表4 RNAa轉(zhuǎn)染后ISK細(xì)胞中Fhit的表達(dá)比較

3 討論

子宮內(nèi)膜癌在全世界發(fā)病率高及治愈率低，科學(xué)家們也一直致力于此腫瘤的發(fā)病機(jī)制研究，希望從分子水平為其診斷、治療及預(yù)后提供幫助。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與癌基因異常激活、抑癌基因失活及DNA錯(cuò)配修復(fù)基因異常密切相關(guān)[5]。而RNAa為近年來基因功能和治療研究領(lǐng)域最熱門的技術(shù)之一，RNAa通過選擇性的激活或增強(qiáng)某個(gè)抑癌基因的表達(dá)來抑制腫瘤生長，而不需要找到腫瘤特定的致癌基因，RNAa效應(yīng)不涉及對任何靶序列的降解，而是通過募集轉(zhuǎn)錄激活因子導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄過程的活化并引起染色質(zhì)修飾的激活。因此，RNAa具有幾乎無限的靶基因，可以提高靶基因mRNA的總豐度，同時(shí)保留mRNA天然拼接異構(gòu)體的多樣性，在轉(zhuǎn)錄及表觀遺傳水平發(fā)揮作用，因此能夠持久激活靶基因，但不改變基因組。這一發(fā)現(xiàn)將開拓性地?cái)U(kuò)展治療腫瘤、代謝及遺傳性等疾病[6]。

表5 Fhit對ISK細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

Fhit基因是1996年OHTA等[7]用差異顯示分析探針及外顯子捕獲法在3p14．2 區(qū)分離鑒定出的一個(gè)抑癌基因，全長1 095 bp，由10個(gè)外顯子組成，外顯子5～ 9構(gòu)成開放閱讀框，編碼1個(gè)由147個(gè)氨基酸組成的、相對分子質(zhì)量16 800，起始外顯子位于t(3;8)異斷裂處的著絲粒側(cè)，t(3；8)的移位可干擾Fhit基因表達(dá)。Fhit 基因存在于上皮性組織中，主要通過參與細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡發(fā)揮作用，它可使細(xì)胞受阻于增殖周期的S期，并激活Caspase酶介導(dǎo)的凋亡級聯(lián)反應(yīng)[8]。綜合目前的研究，該基因在正常組織如子宮內(nèi)膜、卵巢、肺等有不同水平的Fhit mRNA表達(dá)，在人類部分上皮性腫瘤中表達(dá)降低或缺失，且與腫瘤預(yù)后差密切相關(guān)[9]。

在本研究中，我們通過對135例子宮內(nèi)膜癌組織和40例正常子宮內(nèi)膜組織應(yīng)用免疫組織化學(xué)及Western blotting檢測，結(jié)果顯示Fhit蛋白在子宮內(nèi)膜癌中陽性表達(dá)率為21.5%，與正常子宮內(nèi)膜組82.5%相比，陽性表達(dá)率明顯降低，F(xiàn)hit蛋白在2種不同子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明隨著子宮內(nèi)膜組織向癌組織進(jìn)展，F(xiàn)hit蛋白的陽性表達(dá)率明顯降低，F(xiàn)hit蛋白與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生及發(fā)展有明顯相關(guān)性；子宮內(nèi)膜癌中Fhit基因表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級、臨床分期、肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05～P<0.01)。CCK-8試劑盒用于檢測人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中Fhit基因RNA激活后細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長與陰性組相比較明顯減慢，說明Fhit基因被激活后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞倍增時(shí)間明顯延長。Transwell小室模型實(shí)驗(yàn)是研究腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的一種較好方法,它能模擬腫瘤細(xì)胞消化基質(zhì)并穿越屏障侵襲遷移的過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Fhit表達(dá)激活后，能夠穿越屏障的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞與陰性對照組相比較明顯減少，這表明子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲和遷移能力受到抑制，進(jìn)一步證實(shí)了Fhit基因與人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系。

本文研究發(fā)現(xiàn)Fhit基因的表達(dá)缺失與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，檢測其表達(dá)水平對子宮內(nèi)膜癌的早期診斷、臨床進(jìn)展及估計(jì)預(yù)后有一定的參考價(jià)值[10]。通過多因素分析，探討Fhit基因在人子宮內(nèi)膜癌中的抑制作用和子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，為病情監(jiān)測和高危人群的篩查提供更為確切的手段，它的檢測將有助于提高診斷的準(zhǔn)確性和客觀性，對于子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后評估、病情隨訪及合理治療具有一定的指導(dǎo)意義[11]。